HE染色/免疫組化/TUNEL

HE染色

常規染色或HE（Haematoxylin?and?eosin）染色。它是病理技術中最常用的一種方法，通過它可以做出病理診斷和發現尋求別的輔助方法，以達到準確，完整的病理診斷。

染色目的

病理學的所有切片，都必須通過一種以上的染料，通過各種不同的方法，將切片中各種不同的物質，在不同染液的作用下，將其顯示出來，使之在光學顯微鏡下，能夠完全的觀看各種結構。例如，HE染色，好質量的切片可以清晰地顯示出許多不同的結構，細胞核著藍黑色，細胞漿著粉紅色，軟骨著藍色等。清晰的結構為診斷提供可靠的依據，因此，染色技術也是病理技術中的重要組成部分，必須不斷地總結，方能提高。如果染色不好，切片染色一團糟，紅藍不分，結構不清，層次不明，影響了鏡下的觀察，直接影響了臨床診斷，染色結果的好壞直接關系到診斷的準確性。

染色方法及步驟
1．人工蘇木素，伊紅染色法（HE法）
(1)切片浸入二甲苯中5-10min；
(2)切片浸入二甲苯中5-10min；
(3)100%酒精1min。
(4)100%酒精1min。
(5)95%酒精1min。
(6)95%酒精1min。
(7)90%酒精1min。
(8)80%酒精1min。
(9)自來水洗1min。
(10)浸入蘇木素染液浸染10-15min。
(11)自來水洗30second-1min。
(12)1%鹽酸酒精分化30second。
(13)流水沖洗15min以上。
(14)1%伊紅酒精染3-5min。
(15)90%或95%酒精分化30sec。
(16)95%酒精30sec-1min。
(17)95%酒精30sec-1min。
(18)95%酒精30sec-1min。
(19)100%酒精1min。
(20)100%

免疫組化

實驗原理

免疫組化是利用抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑?(熒光素、酶、金屬離子、同位素)?顯色來確定組織細胞內抗原(多肽和蛋白質)，對其進行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學。

操作方法：

（1）在切片組織上滴加0.5%?TritonX-100室溫打孔20min，PBS浸洗切片3次，每次3min。

（2）3%H2O2處理（室溫）15min，PBS浸洗切片3次，每次3min。

（3）山羊血清室溫封閉60min。

（4）取出甩干封閉液（不漂洗）；一抗孵育4℃?過夜。

（5）PBS清洗標本?3次?各?5 min。

（6）二抗工作液孵育37℃?30 min。

（7）PBS清洗標本?3次?各?5 min。

（8）DAB顯色（避光，鏡下觀察至棕色?）1-?10min。

（9）蒸餾水洗?2次?5 min。

（10）蘇木素復染?5min。

（11）自來水洗返藍。

（12）梯度酒精脫水75，85，95，100%各3min。

（13）二甲***透明2次3min。

（14）中性樹膠封片。

原位末端凋亡法（Tunel）實驗技術

TUNEL 技術, 即脫氧核苷酸末端轉移酶( Term inal2deoxynucleo t idyl t ran sferase, TdT)介導的x2dU TP 缺口末端標記(TdT 2m ediatedx2dU TP n ick end labeling, TUN EL )技術, 是目前原位檢測細胞凋亡最敏感、快速、特異的新方法, 已廣泛用于生物、醫學研究領域。
TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling(TUNEL)是一種用來檢測細胞凋亡(apoptosis)的分析方法.細胞凋亡有一項重要的特征為細胞內的DNA會碎裂成片段(DNAfragmentation),TUNEL可以有效的去探測DNA片段的產生,所以可以傳達細胞凋亡的訊息.TdT為terminaldeoxynucleotidyl transferase,此種酵素可以在沒有DNA模板的情形下,連結核甘酸到DNA的3'-OH處.1992年,以色列科學家Gavrieli等人將TdT引為為標定DNA片段的一個酵素,自此衍生出TUNEL此項技術.TUNEL的好處是可以在細胞凋亡發生的早期,即可偵測到DNA片段的產生,并且可以直接使用在組織切片上,觀察細胞凋亡發生的位置.所以TUNEL目前為廣泛接受與使用的一種細胞凋亡的分析方法.?
操作流程

1.石蠟切片，常規脫蠟至水; 石蠟切片4um貼在涂有切片粘合劑的載玻片上，58。C烤24h，常規脫蠟至水，二甲***Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ 各10分鐘，無水乙醇，95%，85%，75%乙醇，各2分鐘，水洗2分鐘。
2．0.3%H2O2作用? 30min,室溫，PBS洗3min×3次；
3．Proteinase K 20ug/ml? 37℃ 20min
4．PBS洗3min×3次；
5．0.1%Triton×100 PBS洗3min×3次；
6．PBS洗3min×3次；
7．TUNEL混合液---1ml Tunel緩沖液中加入10ul? b-11-DUTP, 10ul? TDT, 37C? 1h,室溫1h
8．PBS洗3min×3次；
9．Streptavidin-HRP? 1:400? 37C? 30min
10．PBS洗3min×3次；
11．0.04%DAB+0.03%H2O2顯色10min，流水洗
12．蘇木精襯染1min，鹽酸乙醇分化，水洗
13．常規樹脂封片

結果：

陽性結果為棕黃色（核）或棕褐色，背景呈紫藍色。

威斯騰實驗服務流程

威斯騰生物服務項目