2×高保真長片段快速PCR預混液（含染料）
產品名稱： 2×高保真長片段快速PCR預混液（含染料）
英文名稱： 2×High-Fidelity Long PCR Master Mix (With Dye)
產品編號： N132017
產品價格： null
產品產地： 美國
品牌商標： Arcegen
更新時間： 2025-07-11T09:42:51
使用范圍： null
| 規格 | 價格 |
| 250 μL | 100.0 |
| 1ml | 480.0 |
| 5×1 mL | 1600.0 |
- 聯系人 : 孟醒
- 地址 : 申江南路4388號1幢2層208室
- 郵編 : 201314
- 所在區域 : 上海
- 電話 : 189****7703 點擊查看
- 傳真 : 點擊查看
- 郵箱 : cmeng@magibagbio.com
產品簡介
2×High-Fidelity Long PCR Master Mix (With Dye)是即用型2×預混合溶液，包含High-Fidelity DNA Polymerase，dNTPs以及優化的緩沖體系，預混液中含有預先添加的電泳指示劑，PCR產物可直接進行電泳，擴增產物為平末端，延伸速度為10 sec/kb。其保真性是Taq DNA聚合酶的83倍，是普通Pfu DNA 聚合酶的9倍，適用于復雜模板擴增。2×High-Fidelity Long PCR Master Mix (With Dye)具有快速簡便、靈敏度高、特異性強、穩定性好等優點，反應體系只需加入引物和模板即可。另外，該產品還含有特異保護劑，使得預混液反復凍融后仍可維持穩定活性。
產品信息
|
貨號 |
N132017E |
N132017S |
N132017M |
|
規格 |
250 μL |
1 mL |
5×1 mL |
儲存條件
-25~-15℃保存，有效期1年。
注意事項
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
本產品僅用于科研。
使用說明
1，冰上融化試劑 ，混勻后備用。
2，冰上配制表 1 中的 PCR 擴增反應液。配制完成后充分混勻離心。
3，若模板為粗提樣本 ，建議添加體積不超過反應體系的 5%。
表1. PCR 擴增反應體系
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組分 |
體積 (µL) |
|
模板(10~200ng) |
x |
|
正向引物(10 μM)* |
2 |
|
反向引物(10 μM)* |
2 |
|
2×High-Fidelity Long PCR Master Mix (With Dye) |
25 |
|
ddH2O |
Up to 50 |
*PCR 反應體系中引物終濃度范圍0.4~1μM，引物終濃度過低，會影響擴增效果，若擴增效果不理想，可適當提高引物添加量，提升檢出率。
4，將PCR管轉移到PCR儀根據表2進行片段擴增。
5，推薦PCR擴增程序
表2. PCR 擴增反應程序
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溫度 |
時間 |
循環數 |
|
98°C |
30 sec |
1 |
|
98°C |
10 sec |
30-35（根據實驗要求） |
|
60°C* |
5 sec |
|
|
68°C~72°C** |
5~10 sec/kb |
|
|
72°C |
2 min |
1 |
|
4°C |
Hold |
- |
*退火溫度推薦60°C，也可根據需要，設立溫度梯度摸索引物退火的最適溫度。推薦退火時間為5 sec ，可以在5-20 sec 內調節。退火時間太長可能導致擴增產物在膠上呈彌散狀。
**延伸溫度和時間：10 kb以上長片段或較高GC片段擴增，推薦使用68°C，10 kb及10 kb以下片段且gc在40%~60%的片段擴增，可以嘗試72℃延伸。當擴增效果不理想時，延伸速率根據實際結果可在5 sec/kb~10 sec/kb之間進行調整，擴增片段＜10 kb時，延伸速率可選擇5 sec/kb，當擴增片段≥10 kb時，延伸速率可選10 sec/kb。
6，吸取 5~8 µL 擴增產物，用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳，檢測是否擴增出正確條帶。
應用示例
1，Overlap PCR
1）擴增子1、擴增子2制備
表3. PCR反應體系配制（50 μL體系）
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組分 |
使用量 |
|
2×High-Fidelity Long PCR Master Mix (With Dye) |
25 μL |
|
模板 1 DNA、模板 2 DNA |
10~100 ng |
|
一輪引物 F1（10 μM）、一輪引物 F2（10 μM） |
2 μL |
|
一輪引物 R1（10 μM）、一輪引物 R2（10 μM） |
2 μL |
|
ddH2O |
To 50 μL |
表4.一輪PCR程序
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溫度 |
時間 |
循環數 |
|
98°C |
30 sec |
1 |
|
98°C |
10 sec |
30-35（根據實驗要求） |
|
60°C |
5 sec |
|
|
72°C |
10 sec/kb |
|
|
72°C |
2 min |
1 |
|
4°C |
Hold |
- |
2）Overlap PCR（兩擴增子融合）
表5.二輪PCR反應體系配制（50 μL體系）
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組分 |
使用量 |
|
2×High-Fidelity Long PCR Master Mix (With Dye) |
25 μL |
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一輪擴增產物1（擴增子1） |
2~4μL |
|
一輪擴增產物1（擴增子2） |
2μL |
|
一輪引物F1（10 μM） |
2μL |
|
一輪引物R2（10 μM） |
2 μL |
|
ddH2O |
To 50 μL |
表6.二輪PCR程序設置（與一輪程序相同）
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溫度 |
時間 |
循環數 |
|
98°C |
30 sec |
1 |
|
98°C |
10 sec |
30-35（根據實驗要求） |
|
60°C |
5 sec |
|
|
72°C |
10 sec/kb |
|
|
72°C |
2 min |
1 |
|
4°C |
Hold |
- |
【注】若Overlap產物雜帶較多，可以考慮將一輪擴增產物（擴增子1、擴增子2）純化后，再做二輪擴增。
2，質粒擴增
表7 .PCR 反應體系配制（50 μL體系）
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組分 |
使用量 |
|
2×High-Fidelity Long PCR Master Mix (With Dye) |
25 μL |
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pCAMBIA2301 |
10~100 ng |
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正向引物 F（10 μM） |
2 μL |
|
反向引物 R（10 μM） |
2 μL |
|
ddH2O |
To 50 μL |
表8.PCR程序設置
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溫度 |
時間 |
循環數 |
|
98°C |
3 min |
1 |
|
98°C |
10 sec* |
30-40（根據實驗要求） |
|
60°C** |
5 sec |
|
|
72°C*** |
10 sec/kb |
|
|
72°C |
2 min |
1 |
|
4°C |
Hold |
- |
*若質粒為結構緊密的超螺旋，可以適當延長變性時間。
**退火溫度推薦使用60°C，也可根據需要，設立溫度梯度去摸索引物退火的最適溫度，當產量低時可下調退火溫度，當產物特異性差時，則上調退火溫度。推薦退火時間為5 sec，可以在5-20 sec內調節。退火時間太長可能導致擴增產物在膠上呈彌散狀。
***延伸溫度和時間：10 kb以上長片段或較高GC片段擴增，推薦使用68°C，10 kb及10 kb以下片段且gc在40%~60%的片段擴增，可以嘗試72℃延伸。當擴增效果不理想時，延伸速率根據實際結果可在5 sec/kb~10 sec/kb之間進行調整，擴增片段＜10 kb時，延伸時間可選5 sec，當擴增片段≥10 kb時，延伸速率可選10 sec/kb。