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基因敲入
簡介
? ? ? CRISPR/Cas（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/ Cas）系統是目前被廣泛運用的基因編輯系統，其原理是由CRISPR轉錄產生的gRNA介導Cas核酸酶靶向目標序列，對序列進行切割。其中最常用的是靶向DNA的CRISPR/Cas9系統，此系統是由II類CRISPR/Cas系統改造而來，能夠在植物、細菌、酵母、魚類及哺乳動物等多種細胞中，進行有效的靶向編輯，具有操作簡易、效率高、以及作用靶位點多等優勢。
CRISPR/Cas9系統中sgRNA（short?guide?RNA）識別并結合目標基因的靶向序列，引導Cas9對結合位點進行剪切，產生DNA雙鏈斷裂，通過細胞內的同源重組修復方式，將外源供體DNA定點導入至基因組的靶位點中，從而實現基因敲入。
CRISPR/Cas9基因敲入示意圖（Eric Murillo-Rodríguez et al., Sleep and Vigilance, 2018）
應用
? ? ? 1.CRISPR/Cas9基因片段敲入細胞系建立
? ? ??2.CRISPR/Cas9基因單堿基突變細胞系建立
? ? ? 3.CRISPR/Cas9基因敲入建立動物疾病模型
技術優勢
? ? ??1.操作簡易:僅需Cas9核酸酶、sgRNA和供體DNA片段(donor)，即可定點敲入外源基因片段;
? ? ? 2.效率高:在基因組水平上編輯目標基因，高度模擬目標模型，可精確編輯基因組;
? ? ? 3.廣譜性:無物種限制、無細胞種類限制;
? ? ??4.提供多種基因編輯病毒工具:AAV、LV;
? ? ? 5.提供BSL-1和BSL-2病毒注射及實驗操作平臺;
? ? ??6.全面的實驗技術支持。
服務內容
? ? ? 1.sgRNA的設計;
? ? ??2.細胞內sgRNA剪切活性篩選;
? ? ? 3.敲入載體的構建:Cas9-sgRNA表達質粒、donor質粒;
? ? ? 4.依據所要編輯的細胞選擇Cas9、sgRNA和donor不同導入方式:
? ? ? ? ? ??a、脂質體易轉染細胞:使用質粒系統( Cas9、sgRNA和donor ) ;
? ? ? ? ? ??b、脂質體難轉染細胞:使用質粒系統電轉化、慢病毒或腺相關病毒感染( Cas9、sgRNA和donor ) ;
? ? ??5.篩選基因敲入單克隆細胞系。
服務流程
客戶提供
? ? ? 1.?目的基因序列（序列/ID）以及物種來源；
? ? ? 2.?靶細胞系及細胞培養條件（可選）；
? ? ? 3.?病毒類型選擇以及要求；
? ? ??4.?血清型選擇。
服務信息及最終交付內容、產品
? ? ??聲明：樞密科技提供的所有基因編輯服務及該服務的后續研究，僅適用在國家法律和倫理規范的范圍內實施。禁止用于任何人體或臨床實驗的研究；禁止用于對人類生殖體系進行基因修飾的研究；禁止將基因修飾的其他動物胚胎及生殖細胞植入人體。客戶如違反相關法律規定，本公司不承擔任何法律責任。
案例展示
? ? ? Yang H等人研究發現，通過同源重組在Nanog基因第4個外顯子末端插入報告基因熒光蛋白cherry（A）。Southern顯示重組成功（B）。Nanog基因只在胚胎干細胞表達，干細胞分化后Nanog基因不再表達，表現為干細胞表達熒光蛋白cherry，分化后的細胞無熒光（C）。
（Yang H et al. Cell, 2013）
參考文獻
? ? ? [1]?Eric Murillo-Rodríguez, Rocha N B , André Barciela Veras, et al. The End of Snoring? Application of CRISPR/Cas9 Genome Editing for Sleep Disorders[J]. Sleep and Vigilance, 2018, 2(1):1 3-21.
? ? ??[2]?Yang H, Wang H, Shivalila CS, et al. One-Step Generation of Mice Carrying Reporter and Conditional Alleles by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering. Cell. 2013;154(6):1370-9.