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腺病毒包裝純化實驗

摘要： 利用AdMax系統在HEK293細胞中獲取表達Oct-4-EGFP- 3FLAG的重組腺病毒，經擴增、純化、檢測后留待后續功能學研究。
關鍵詞：AdMax， Oct-4， EGFP，重組腺病毒

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一、?實驗原理
腺病毒是一種無包膜病毒，直徑在70～90nm。病毒顆粒由252個殼粒呈二十面體排列組成，每個殼粒的直徑約為7～9nm。位于衣殼中的基因組是線狀雙鏈DNA，長度約為36 kb，兩端各有長約100 bp的反向重復序列。腺病毒在自然界分布十分廣泛，在很多哺乳動物和禽類中都有發現，其對上皮細胞，角膜和消化道上皮細胞具有一種天然的侵嗜性?，F已發現的51種人腺病毒，根據組織嗜性不同被分成ABCDEF六個不同亞群，其中C亞群的第2和第5血清型最常被用于構建腺病毒載體。

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腺病毒的雙鏈DNA基因組分為編碼區和非編碼區。根據DNA復制周期的不同，編碼區又分為早期基因區和晚期基因區。前者又細分為E1～E4四個區，主要負責編碼調節蛋白；而后者分為L1～L5五個區，負責編碼結構蛋白。腺病毒基因組中早期表達的調節蛋白可以調控晚期基因的表達，其中最先表達的是E1區基因，它所表達的蛋白(包括E2產物) 是腺病毒基因組復制、病毒包裝和其他蛋白表達所必需的。在非編碼區，腺病毒雙側末端各含有一小段約100bp的末端反向重復序列(ITR)。ITR含有病毒進行復制和包裝所必需的順式作用元件及DNA復制起始點，它是病毒DNA復制所必需的，其內側包含病毒包裝信號(ψ)。
腺病毒作為一種病毒載體具有以下優點：（1）宿主范圍廣， 對人致病性低；（2）基因組信息完全清楚，易于操作，可以插入大片段的外源基因；（3）容易獲得較高滴度；（4）不與基因組整合，瞬間表達，安全性較高；（5）可以感染多種人類細胞，（包括分裂期和非分裂期細胞）；目前較為成熟的載體系統有非復制型（如AdMax）和復制型（又叫溶瘤腺病毒）兩種。
AdMax包裝系統是由加拿大microbix公司經銷，廣泛被科研用戶使用的腺病毒載體系統。它的工作原理是，利用Cre/loxP（或FLP/frt）重組酶將攜帶外源基因的穿梭質粒與骨架質粒在HEK293細胞中實現重組，產生腺病毒 （見AdmaxTM重組腺病毒流程圖）。該系統具有操作簡便、重組效率高、病毒產率高、目的基因表達水平高等優點，同時mCMV啟動子較hCMV啟動子的啟動效率也要高出若干倍。

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關于AdMax腺病毒包裝系統的詳情，請登陸網站：http://microbix.com/products/adenovirus-vectors/admax/

二、?實驗目的
獲取足夠純度和滴度的重組腺病毒Adeno-Oct-4-EGFP-3FLAG。

三、?實驗步驟
將目的穿梭質粒pAdeno-mCMV-Oct-4-EGFP-3FLAG與腺病毒骨架質粒共轉染到HEK293細胞中重組獲得病毒Adeno-Oct-4-EGFP-3FLAG，經大量擴增后純化，檢測滴度和目的基因表達水平后備用。實驗步驟如下：
1.?病毒包裝與鑒定：
1)?轉染前一天，將細胞接種到6孔板中，控制細胞轉染時的密度為70-80%。
2)?轉染前一小時取出細胞培養板，去除原有細胞培養基，加入1.5ml的Opti-MEM培養基，將細胞放回培養箱。
3)?制備轉染試劑和質粒的復合物：
a)?將待轉染的病毒載體質粒4μg（骨架質粒：穿梭質粒=1:1）溶于Opti-MEM培養基，總體積為250 μl，輕輕混勻。
b)?將和元生物腺病毒包裝轉染試劑溶于Opti-MEM培養基，總體積為250 μl，輕輕混勻。
c)?將和元生物腺病毒包裝轉染試劑稀釋液滴加到質粒稀釋液中，邊加邊輕輕混勻后在室溫放置20min，使DNA和轉染試劑充分結合形成穩定的轉染復合體。
d)?取出細胞培養板，將上面配好的DNA-轉染試劑復合體加入到細胞培養板中，做好標記，放回培養箱。
e)?6h后吸去培養基，PBS洗一次，加入2ml新鮮完全培養基培養。
f)?每三天換液一次，大概7-15天左右出現病毒空斑，待完全病變后收集上清液。
2.?病毒大量擴增與純化：
將HEK293細胞鋪于30-40個10cm dish，待細胞長至70-80%，每塊板加入合適滴度的病毒（約107-108PFU/ml）10 μl，感染細胞，待細胞全部病變后（2-3天），每塊板中加入約500 μl 10% Nonidet P 40（NP40）以裂解細胞。收集細胞裂解物，12000 rpm離心10 min，棄細胞碎片收集上清。每100ml上清加入50 ml病毒沉淀液（20% PEG8000，2.5M NaCl），冰上放置1h以沉淀病毒。12000 rpm離心上述混合物20min，棄上清，將沉淀物懸浮在10 ml 密度為1.10g/ml的CsCl溶液中（溶劑為20 mM Tris-HCl，pH 8.0）4℃ 7000rpm離心5min，收集病毒懸浮液。
在超速離心管中加入2.0 ml的1.40g/ml CsCl 溶液（溶劑同上）。再加入3.0 ml 1.30 g/ml 的CsCl 溶液。最后加入5 ml的病毒懸浮液。22800 rpm，4℃離心2.5h。收集密度在1.30-1.40g/ml 之間的病毒條帶至透析袋中(透析袋使用前用10 mM 的EDTA Na2煮沸10 min)。在透析緩沖液（50g蔗糖，10ml 1M pH為8.0的Tris-HCl液，2ml 1M MgCl2溶液定容至1000ml）中，4℃透析過夜，中間更換透析液一次。收集病毒，于-80℃保存。
三種密度的CsCl溶液配制如下（溶于滅菌20 mM Tris，pH8.0），4℃保存。

?????????????????????????????????????????????????????????????????????????? CsCl溶液配制

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3.?病毒滴定測定：
1)?選取狀態良好的HEK293細胞，使用完全培養基重懸細胞，制備成5.0×105個/ml的細胞懸液，24孔板每個孔中種入1ml細胞，
37℃、5%CO2培養。
2)?準備好10倍梯度稀釋的病毒樣品，然后依次將10-5至10-8稀釋的病毒液加入24孔板中，每孔加入100μl。
3)?37℃、5%CO2感染48h。輕輕的去除培養液，沿著24孔板側壁緩緩加入預冷的甲醇500μl，-20℃固定20min。
4)?使用PBS輕輕的沖洗細胞3次，每次5min。
5)?加入200μl 1%BSA 37℃封閉1h。
6)?加入200μl的一抗溶液至每個孔中，37℃孵育1h。
7)?使用PBS輕輕的沖洗細胞3次，每次5min。
8)?加入200μl的二抗至每孔，37℃孵育1h。
9)?使用PBS輕輕的沖洗細胞3次，每次5min。
10)?加入200μl新配置的工作液至每孔，室溫孵育5-10min。
11)?棄工作液，使用PBS清洗2次，每孔每次加入1ml PBS。
12)?每孔隨機選擇5個視野，使用光學顯微鏡10×物鏡下計算陽性細胞個數。
13)?計算每孔陽性細胞的平均個數和病毒滴度。

4.?目的基因表達檢測：
腺病毒感染工具細胞-293T，WB檢測病毒表達情況（24孔板為例）。
第一天：細胞準備：
將長勢良好的293T細胞接種到24孔板，消化好細胞后把細胞濃度調為1×105個/ml，按500μl/孔加入。接種細胞數量因細胞的生長速度而略有不同，一般是保證第二天進行病毒感染時細胞匯合率介于30-50%之間。
第二天：病毒感染：
感染實驗分兩組，一組直接添加病毒液，一組同時添加。病毒液10倍倍比稀釋，共三個稀釋度，MOI值依次為100，10和1。每個MOI值加兩個孔，取出一組加入感染增強劑，終濃度為5μg/ml。中間每隔15-20min搖晃一次培養板，增加感染效果。感染過程盡量使用無血清培養基。感染293T細胞無需Polybrene，無需無血清處理，直接按照MOI=1-10感染。
第二天：換液：
感染實驗同一天，1.5-2h后（中間每半小時均勻搖晃一次，增加感染效率），棄去上清，換5%血清的培養基，500μl/孔。
(注：某些特殊細胞需要更換一半病毒液后，過夜，具體請咨詢公司技術支持信箱：techservice@oobio.com.cn)
第三天：觀察熒光表達情況：
在倒置熒光顯微鏡下觀察熒光，估計腺病毒感染目的細胞的效率。對于生長緩慢的細胞，可以適當推遲一天觀察的時間，以保持細胞良好的生長狀態。通過細胞感染的效果，確認目的細胞的感染MOI。對于因目的基因較大，載體無法攜帶標記基因的，細胞感染腺病毒后大約48h后蛋白表達達到峰值。注：通常未知細胞感染腺病毒的最佳MOI值，需要首先選擇96孔板進行摸索，后續放大的原則是保持細胞的密度不變，將培養基體積，病毒量按實際細胞數與預實驗細胞數的比例放大。即使這樣，放大實驗時由于體系的改變，加上預實驗的MOI值設置跨度大小，需要對MOI的再次優化。MOI的設置值為預實驗最佳值0.5倍，1倍和1.5倍或自己設置合理的數值。

??????????????????????????????????????????????????????????? 病毒感染細胞所用培養基體積和病毒量參考值
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*表中可培養板底參數數值為CORNING公司產品參數。
*對于孔面積較小的培養板，由于溶液張力的關系，培養基體積太少會導致病毒的分布不均與，所以不做減半處理。
293T感染24h-48h均可以收集樣品進行WB檢測

四、?實驗結果

?????????????????????????????????????????????????????????????????????? 包裝熒光拍照質控結果
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????????????????????????????????轉染后第9天時觀察，HEK293細胞大量飄落，細胞已經完全病變。

Adeno-Oct-4-EGFP滴度結果：
??? 本次實驗在顯微鏡下５個視野中計算的陽性細胞平均數為8，此孔病毒稀釋了107倍，根據以上公式得出：病毒滴度=8×79×107/0.1=6.32×1010（Ifu/ml）

??????????????????????????????????????????????????? ??? 滴度結果圖片
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??? 備注：照片所拍攝的視野通常小于顯微鏡下觀察的視野，因此需要在顯微鏡視野下計算陽性細胞的個數。

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如沒有檢測滴度的試劑，可以直接檢測腺病毒VP數，作為參考值，方法如下：
1.?要用Virus lysis buffer裂解腺病毒，取6μl病毒加入54μl Virus lysis buffer，第三次透析液為空白對照，做好標記。
2.?水浴裂解，56℃，10min。
3.?測dsDNA，OD260，首先用空白對照調零，然后放入樣本讀數，若在0.1-1.0之間，則可以準確反映病毒濃度，否則需要稀釋或加濃。
4.?計算腺病毒濃度：病毒滴度=OD260×稀釋倍數×1.1×1012（VP/ml）。
注：通常該方法檢測的滴度值較PFU數值，偏高2個數量級，請參考。
5.?293T感染24h-48h均可以收集樣品進行WB檢測。
腺病毒常見問題：
關于腺病毒滴度單位：
1.?VP測定法（病毒顆粒）或OPV（光學顆粒單位）：
測定VP的方法是測定病毒顆粒在260nm處的吸光度（病毒DNA和蛋白的總吸光度中主要為DNA），1個OD值相當于1.1×1012個病毒顆粒。這種方法只能檢測病毒的總顆粒數，而不能確定其中有感染活性的病毒顆粒。
2.?GTU測定法（基因轉移單位）：?
GTU測定感染后能表達報告基因的細胞數量。這個過程中，病毒將DNA轉入細胞，在一個感染周期結束前立即測定表達報告基因的細胞。如果重組腺病毒含有報告基因如GFP或LacZ等則可以用這種方法進行測定。
3.?PFU測定法（空斑形成單位）：?
PFU是測定腺病毒滴度最早的標準方法，主要測定單層細胞培養中病毒空斑的形成。空斑形成需要許多個感染周期，得到最終結果通常需要三個星期。一般來說，這種方法得到的結果很少能在其它實驗室重復。
4.?關于腺病毒保存和稀釋方法：
若病毒量需長期保存，必須在-80℃保存，特別是純化之后。在最佳的緩沖液（10mM Tris HCl pH 8.0，2 mM MgCl2，4% Sucrose）病毒會穩定1-2年，通常超過6個月后，應該重新檢測滴度。病毒使用切記反復凍融，否則會降低病毒滴度。每次凍融導致病毒滴度降低10%左右。普通稀釋液保存，每次凍融滴度損失會近一半。在DMEM中用血清保存的方式與純化顆粒一致，但由于血清保護通常比在緩沖液中更加穩定。可以在DMEM中用血清在4℃存儲病毒一周以上而不需要反復凍融。
5.?腺病毒在整體動物水平的使用：
體內試驗的腺病毒，建議使用純化過的病毒。因為小擴病毒中含有缺損顆粒、大量的腺病毒fiber和penton蛋白（細胞毒素）、培養基、血清以及細胞碎片。腺病毒用量范圍在108-9PFU/只小鼠，每隔一天注射一次，共注射4次。小鼠肌注腺病毒后，3~4天目的蛋白的表達達到高峰，一周后逐漸下降，持續表達時間在兩周左右。靜脈注射小鼠（昆明鼠），半致死劑量LD50大約為1×1011v.p./只；裸鼠和SCID鼠可能更敏感一些。肌注方式的LD50測到：1×1012v.p./只給藥，未發現小鼠死亡。
由于腺病毒在整體動物實驗的復雜性和多樣性，請直接將您的問題和建議與我們的動物工程師討論，和元生物動物實驗中心的腺病毒技術工程師也愿意與您分享他們在這一領域的經驗，熱線電話400-1515-198技術支持電子郵件techservice@oobio.com.cn。

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五、?參考文獻
1.?Bewig, B., W. E. Schmidt (2000) Accelerated titering of adenoviruses. BioTechniques 28:870-873.

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