內質網定位表達載體（陽性對照，哺乳動物細胞）

產品信息

產品描述

重組蛋白功能研究時，常需要將其在細胞內定位到具體的細胞器，例如細胞核（nucleus）內、細胞質（cytoplasm）內、線粒體（mitochondria）或內質網（endoplasmic reticulum）上等。而細胞內某種蛋白的存在部位取決于蛋白序列中的“定位序列”（targeting sequences）或“信號肽”，這些序列可能位于蛋白質的N端、C端或蛋白質內部。一旦蛋白質被轉運到最終細胞部位，這些序列可能會被保留，也可能被切除。研究者可以根據自己的研究目的，將感興趣的ORF片段構建到表達載體中進行研究。

pCMV/myc/ER/GFP細胞質定位表達載體（陽性對照，哺乳動物細胞）是以pcDNA3.0為基本骨架改造的質粒，可進行哺乳動物細胞瞬轉和穩轉，它在細胞質內高水平表達綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）。作為細胞質定位載體的陽性對照質粒，它可用于優化細胞系轉染條件，幫助確認目的蛋白在細胞質內的表達。

產品性質

運輸和保存方法

冰袋運輸。

-20℃保存。有效期半年。長期保存，請保存于-80℃。

注意事項

1）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

2）本載體在綠色熒光蛋白C端加有Myc標簽。

3）大多數培養基由于含有核黃素而發熒光，干擾GFP熒光檢測。因此，熒光檢測時，應去除培養基，用PBS洗3次左右。

4）質粒轉染后，應建立時間梯度摸索檢測細胞GFP的最佳時間，以判定轉染效率。因轉染細胞類型的不同，時間優化在轉染后12?h至96?h不等。

pCMV/myc/ER MCS

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【注1】：pCMV/myc/ER/GFP是pCMV/myc/ER質粒在PstⅠ限制性內切酶和NotⅠ限制性內切酶雙酶切后的部位插入GFP基因改造而得。

【注2】：信號肽包含一個內含子和兩個外顯子。蛋白表達過程中，內含子被切除，剩下信號肽的兩個外顯子及重組蛋白。

【注3】：編碼重組蛋白的目的基因CDS區位置需在內質網信號肽的第二個外顯子后，即BssHⅡ至NotⅠ多克隆酶切位點之間。

【注4】：帶有信號肽的重組蛋白一旦轉移進入內質網，便會在絲氨酸處切割掉信號肽，若帶有內質網滯留信號（ER retenti-on signal，SEKDEL），則蛋白就位于內質網中。利用此質粒表達的重組蛋白C端帶有SEKDEL肽和c-myc標簽，因此重組蛋白分子大小會增加約2 kD。

【注5】：若基因CDS包含終止密碼子，則重組蛋白不帶有SEKDEL肽和c-myc標簽，此時需根據蛋白本身性質定位蛋白，如果該蛋白為分泌蛋白，則該蛋白會分泌；而如果該蛋白為非分泌蛋白，則該蛋白可能會非特異性的停留在內質網中。

【注6】：使用BssHⅡ酶切位點時，應注意內質網信號肽（ER signal peptide）完整性。因此，設計引物時，應在上游引物?5’端添加?BssHⅡ酶切位點至定位序列的最后一個堿基。

【注7】：pCMV/myc/ER質粒上游測序引物為pCMV Forward primer，序列為5’-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3’；下游測序引物為BGH Reverse primer，序列為5’-?TAGAAGGCACAGTCGAGG-3’。

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