原位末端標記染色（TUNEL）

TUNEL原理

? ? ? ?細胞在發生凋亡時，會激活一些DNA內切酶，這些內切酶會切斷核小體間的基因組DNA。細胞凋亡時抽提DNA進行電泳檢測，可以發現180-200bp的DNA ladder。基因組DNA斷裂時，暴露的3’-OH可以在末端脫氧核苷酸轉移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 的催化下加上熒光素 (FITC) 標記的dUTP (fluorescein-dUTP) ，從而可以通過熒光顯微鏡或流式細胞儀進行檢測，這就是TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling) 法檢測細胞凋亡的原理。

常見問題

1、出現非特異性熒光標記

a. 有些細胞或組織，例如平滑肌細胞或組織，nuclease或polymerase的酶活性水平較高，易導致出現非特異性的熒光標記。解決方法是，取細胞或組織后立即固定并且要充分固定，以阻止這些酶導致假陽性。

b. 使用了不適當的固定液，例如一些酸性固定液，導致出現假陽性。建議采用推薦的固定液。

c. TUNEL檢測反應時間過長，或TUNEL檢測反應過程中反應液滲漏，細胞或組織表面不能保持濕潤，也可能出現非特異性熒光。注意控制反應時間，并確保TUNEL檢測反應液能很好地覆蓋樣品。

2、熒光背景很高

a. 支原體污染。請使用支原體染色檢測試劑盒檢測是否為支原體污染。

b. 高速分裂和增殖的細胞，有時也會出現細胞核中的DNA斷裂。

c. TUNEL反應過強?？梢杂迷噭┖刑峁┑腡dT酶稀釋液稀釋TdT酶2-5倍后再按照說明書操作。稀釋后的TdT酶需當日使用。

d. 紅細胞中血紅蛋白導致的自發熒光產生嚴重干擾。此時宜選擇其它細胞凋亡檢測試劑盒。

3、標記效率低

a. 使用乙醇或甲醇固定會導致標記的效率較低。

b. 固定時間過長，導致交聯程度過高。此時宜減少固定時間。

c. 熒光淬滅。Fluorescence在普通光照10分鐘就會嚴重淬滅。解決方法是需注意避光操作。

d. 碘化丙啶雙染時，如果碘化丙啶染色過深會導致觀察到的本試劑盒的TUNEL染色效果減弱。碘化丙啶可以接受fluorescein激發產生的熒光，從而起到淬滅作用。解決方法是用較低濃度的碘化丙啶染色，例如0.5μg/ml碘化丙啶。