Hieff UNICON® ColorGPS qPCR SYBR Green Master Mix (Low Rox) 是2×實時定量PCR擴增的預溶液，具有熒光強度高，靈敏度高和特異性強，擴增產量高等特點。核心組分Hieff UNICON® Taq DNA聚合酶采用抗體法熱啟動，可以有效抑制樣品準備過程中引物退火導致的非特異性擴增。同時配方添加了提升PCR反應擴增效率因子和均衡不同GC含量（30~70%）基因擴增的促進因子，使定量PCR可以在寬廣的定量區域內獲得良好的線性關系。該產品利用不同染料的混合變色反應來監控移液操作，有效降低了移液誤差的發生。

產品組分

• 移液追蹤：降低漏加/錯加風險
• 擴增優異：在寬廣的線性范圍內有良好的線性關系
• 精準度好：可精準區分2倍濃度差異模板
• 重復性好：復孔孔間差異小，有更好的重復性
• 穩定可靠：反應體系可于常溫放置24小時，產品反復凍融20次不影響

• 移液追蹤，降低漏加/錯加風險

移液追蹤，進程清晰。使用產品按照按照說明書進行加樣，其中混有不同顏色染料的模板最終投入量均為2 μL。觀察顯示翌圣新品移液追蹤可清晰展示加樣進程。注：11189ES為11188ES的Low Rox版本。

• 擴增優異，動態范圍內可獲得可靠的結果

動態范圍內可獲得可靠的結果。以2 µL的10¹-10⁷梯度的質粒為模板，擴增相關基因。Hieff UNICON® ColorGPS 預混液可有效檢測7個數量級范圍的模板量，在寬廣的線性范圍內獲得良好的線性關系。注：11189ES為11188ES的Low Rox版本。

• 可精準分辨2倍模板濃度差異

可精準分辨2倍模板濃度差異。以2 µL的質粒的2倍梯度稀釋液為模板，擴增相關基因。Hieff UNICON® ColorGPS 預混液能夠精準分辨模板濃度差異。注：11189ES為11188ES的Low Rox版本。

• 不同類型樣本基因擴增出色

• 適用于標準或快速程序

更加靈活，適用于標準或快速程序。標準程序中變性時間和延伸時間分別設置為10秒和30秒，快速程序中變性時間和延伸時間分別設置為3秒和10秒，檢測10個目標基因對應的C_T值。結果顯示，新品在標準和快速程序中得到的C_T值相關性強，新品使用快速程序能夠獲得良好的結果。注：11189ES為11188ES的Low Rox版本。

• 反應體系可在室溫下穩定保持24小時

制備完反應體系后，可在室溫下穩定保持24小時。分別以小鼠、人293細胞、擬南芥不同基因作為靶標，制備完反應體系后，在不同溫度中避光放置24小時再進行檢測。相較于即刻上機，不同基因檢測差異不超過0.5個C_T，表明長時間操作也可獲得穩定結果。注：11189ES為11188ES的Low Rox版本。

• 儲存穩定可靠

試劑于不同溫度放置7或14天，仍能夠保持較好的穩定性。新品分別在25℃放置14天和在37℃放置7天。以不同樣本不同基因作為靶標進行擴增檢測。數據顯示，試劑儲存穩定性好，得到的C_T值相差不大，不超過0.5個C_T。注：11189ES為11188ES的Low Rox版本。

試劑反復凍融多次，仍能夠保持較好的穩定性。將新品凍融20次后，分別以小鼠、人、擬南芥不同基因作為靶標進行qPCR。ΔC_T 值顯示，試劑反復凍融后，得到的C_T值相差不大，不超過0.5個C_T。注：11189ES為11188ES的Low Rox版本。

-25~-15℃避光保存，有效期18個月。

1.如何根據不同的儀器型號，選用適當的熒光定量試劑呢？

見翌圣生物翌圣生物染料法熒光定量PCR Mix選購表，點擊此處查看詳情，幫您選擇適當的試劑。

2. 試劑用之前如何混勻？

針對分子酶試劑，上下顛倒混勻后，輕微離心即可。不建議劇烈震蕩混勻。

3.黃色稀釋液怎么用？可以選擇不用么？

見說明書，最終需要保證和模板混合后在1×即可。例如20μL cDNA原液，加無菌超純水180μL稀釋10倍，得到200μL稀釋模板，取90μL稀釋模板，加入10μL 10×Dilution Buffer，混勻后使用即可?？梢赃x擇不用，不影響。

4.cDNA模板需要稀釋么？該稀釋多少倍呢？

可以選擇使用cDNA原液或者進行稀釋。保證自己想要的基因Ct值落在15-30之間即可。通常cDNA每稀釋10倍，Ct值增大3.3。

5.反應體系配制好了，但是排不上機，怎么辦？

避光放置，反應體系不能敞口放置，這兩項是必要項?？梢苑旁?℃冰箱或者常溫中24小時，用之前輕微震蕩+離心上機，上機前仔細檢查下管子/板子有沒有被弄臟。

6.引物設計怎么做？

引物設計時最好跨內含子設計，設計方式參考【過癮！一文搞懂qPCR引物設計，實驗達人必備技能！】，也可以選用驗證過的引物，選用方式參考【去哪里找現成的qPCR引物序列？】

7.儀器上數據報告BadRox錯誤，怎么辦？

可能的原因如下：

①儀器長時間沒有校準或儀器老化。通常儀器需要每年校準一次，需要請儀器工程師進行校準或替換老化零部件。

②使用了10μL反應體系，正常使用體系是20μL體系，折半使用會導致Rox總濃度過低，發生BadRox的概率上升，建議使用20μL體系進行實驗。

8.該產品的qPCR產物能不能跑凝膠電泳？

qPCR產物的特異性通常可以通過熔解程序進行判斷。若仍需要通過凝膠電泳的形式判斷產物，該產品的qPCR可以進行電泳，電泳需要Loading Buffer，產物不可直接上樣電泳。

9.擴增結束后，未出現擴增曲線？

①確認程序中信號采集是否打開。若采用兩步法，需將信號采集設置在退火延伸階段。

②產物長度是否太長。若產物長度設置為500bp及以上，則可能會出現此類情況。建議將在引物設計時，將產物控制在80-300bp之間。

③引物是否不適合。若引物設計不適合，則需要重新設計引物。若引物設計正確但疑似降解，可用PAGE電泳檢測引物完整性。

④模板降解：重新制備模板，重復實驗。

10.NTC出現CT值，怎么辦？

通過觀察熔解曲線進行判斷分析。

①熔解曲線顯示，NTC與對應基因熔解峰形不重疊且NTC的TM值較對應基因的TM值小。該情況下，NTC對應的產物是引物二聚體。若對應基因的熔解曲線峰形都是單一峰，則相關基因信號采集不影響。

②熔解曲線顯示，NTC與對應基因熔解峰形重疊。該情況下，NTC對應的產物大概率是對應基因產物。體系受到污染，逐一排查水/引物/試劑是否受到污染，若以上均未受到污染，則可能是氣溶膠污染。針對已得到的擴增數據，通過計算NTC與對應基因CT值差值來判斷，ΔCT值≥5，表明污染對體系影響小，可忽略。

11.NRT出現CT值，怎們辦？

表明存在基因組DNA污染。建議使用去除基因組的RNA提取試劑盒進行RNA提取或反轉錄時加入去基因組步驟?；蛘咭镌谠O計時采用跨內含子設計。

12.復孔間重復性差怎么辦？

①CT＜30，但是重復性很差怎么辦？

• 提升加樣準確度。避免小體積加樣，減少加樣誤差，可通過配制大體系的方式保證，例如將引物、水、qPCR Mix混合成大體系或者采用引物和水混合成大體系的方式。大體系需要混合均勻。
• 提升移液器吸取的準確度。移液器通常需要定期校準，一年一校準。

②CT≥30，但是重復性很差怎么辦？

此時由于有效模板豐度較低，模板和引物之間碰撞的隨機性增大，從而導致復孔間差異變大。可嘗試增加2-3個復孔，后續剔除差異大的數據進行數據分析。

13.熔解曲線出現雜峰怎么辦？

①熔解曲線雜峰出現在主峰左側。可能是引物二聚體導致的這類情況，可嘗試提高退火溫度、降低引物濃度或重新設計引物解決。

②熔解曲線雜峰出現在主峰右側。

a.是可能由于引物特異性差導致的非特異擴增。需要重新設計引物。

b.是可能由于模板基因組DNA污染。需要建議使用去除基因組的RNA提取試劑盒進行RNA提取或反轉錄時加入去基因組步驟等方式重新制備cDNA模板。