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和元生物踐行“賦能基因治療，共守生命健康”的使命，以核心技術升級、工藝開發升級、成本控制升級，提升基因治療遞送載體的可及性。即日起， AAV包裝低至3980元起，慢病毒包裝低至1980元起，用實業回報社會、用科技振興行業，讓基因遞送觸手可及！


AAV
和元生物生產的每一個rAAV都經歷數十道工序的錘煉，隨機檢測的rAAV空殼率<2%、內毒素＜2.5EU/mL；同時，每批rAAV產品在出庫前均會進行多輪滴度測定，保證產品的滴度準確，更好地指導實驗研究。此外，我們使用大規模GMP級病毒包裝質粒，用于研究級rAAV病毒載體的生產，全力減少批次間差異，降低雜質及污染，讓基因遞送觸手可及！

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讓基因遞送觸手可及！
Make Gene Delivery Accessible.

Oct-4 過表達2型重組腺相關病毒包裝純化實驗

摘要：本實驗使用 AAV-2無輔助病毒系統，獲得高滴度的過表達human Oct-4基因的重組腺相關病毒顆粒，并使用qPCR方法測定病毒滴度。該病毒系統中外源基因的表達框為pAAV-CMV-Oct-4-IRES-ZsGreen-EGFP：CMV啟動子驅動Oct-4基因的表達， 同時由IRES原件驅動ZsGreen基因的表達，可以用于觀察重組腺相關病毒的工作狀況。
關鍵詞：AAV無輔助病毒系統，Oct-4，高滴度重組腺相關病毒包裝，qPCR

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一、?實驗原理
腺相關病毒屬微小病毒( parvovirus)家族的成員，為無包膜的單鏈線狀DNA病毒。AAV的基因組約4700bp，包括上下游兩個開放讀碼框架(ORF)，位于分別由145個核苷酸組成的2個反向末端重復序列(ITR)之間。重組腺相關病毒具有安全性高、免疫原性低、能介導基因在動物體內長期穩定表達，因而被認為是最有潛力成為基因治療工具的載體而在國內外研究中廣泛應用。
包裝重組腺相關病毒時有9中不同的AAV血清型可供客戶選擇，建議客戶針對不同組織器官選擇相應血清型的AAV病毒，見下表。 重組腺相關病毒可用于基因的過表達 （3kb以下）、shRNA（單條或者多條串聯）、miRNA（pre-miRNA或者pri-miRNA）以及可誘導表達。

??????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? ????? 9種不同血清型對各組織器官細胞的親和性

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重組腺相關病毒包裝技術服務包含內容：
1.?重組腺相關病毒載體的構建：將目的基因克隆構建到腺相關病毒載體，根據不同的研究需求，有用于基因過表達的重組腺相關病毒載體、?????
用于RNAi的重組腺相關病毒載體等。
2.?重組腺相關病毒病毒包裝：重組腺相關病毒載體與輔助載體（客戶選定的不同血清型）一起轉染AAV-293細胞進行包裝，將包裝好的病毒純化和濃縮。
3.?重組腺相關病毒鑒定與質量控制：載體測序鑒定、QPCR測定滴度、感染活性測定。
最常用的重組腺相關病毒載體：

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??????????????????????????重組腺相關病毒基因過表達載體

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?????????????????????????????重組腺相關病毒基因干擾載體

二、?實驗目的
使用AAV-2無輔助病毒包裝系統獲得高滴度的過表達human Oct-4基因的AAV-2病毒顆粒，用于研究Oct-4基因功能學研究。

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三、?實驗步驟
1.?AAV血清型以及載體的選擇及構建：
本實驗選擇AAV-2， 并采用pAAV-CMV-Oct-4-IRES-ZsGreen過表達載體，將human Oct-4基因構建到CMV啟動子下游， 位于β-globlin 內含子與IRES元件之間。
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2.?病毒包裝：
1)?復蘇AAV-293細胞到15cm 培養皿中。24-72h后，當細胞達到70%匯合度的時候，1:3分盤。48h后，1:10分盤。48h后可以進行質粒轉染。
2)?使用obio病毒包裝轉染試劑，按照使用說明，三種質粒（pHelper：pAAV-RC2：pAAV-CMV-Oct-4-IRES-ZsGreen=1：1：1）共轉染AAV-293細胞。
3)?轉染60h后，使用細胞刮將細胞刮下，并收集到離心管。
4)?1500g 4℃離心5min。將細胞沉淀重懸在7ml 的 10mM Tris-HCl 緩沖液中。
5)?細胞可-80℃保存直到進行純化。

3.?病毒純化：
1)?取細胞裂解液在干冰/乙醇浴-37℃水浴中反復凍融8次。
2)?使用10mM Tris-HCl?將裂解液定容到21ml。
3)?使用Misonic Sonicator超聲儀超聲7min（輸出2）。
4)?加入2ml DNase I（3mg/ml）37℃孵育30min。
5)?再次超聲7min。
6)?加入2.5ml 10% 脫氧膽酸鈉，2.1ml 0.25%胰酶-EDTA，混合均勻后37℃孵育30min，冰上放置20min。
7)?加入16.9g CsCl?；旌暇鶆蚝螅?7℃孵育20min。中間搖動，直到CsCl完全溶解。
8)?4℃3000g離心30min，小心地將細胞裂解液轉移到超速離心管（約5ml/tube）。
9)?4℃53,000rpm (266,400g)離心30h。
10)?使用自制的針頭收集病毒層。
11)?4℃透析，12-16h換透析液，每次使用4L緩沖液。

4.?滴度檢測：
1)?取2μl 純化后的病毒液加入50μl PCR 堿性裂解液中，100℃，加熱10min。放置冰上10min，加入50μl中和緩沖液。（同時準備質粒對照模板：106-1011拷貝/μl）。
2)?按照以下體系準備qPCR樣品（20μl體系）：10μl SYBR green master mix， 0.3μl 正向引物，0.3μl 反向引物，1μl模板，8.4μl 水（RSV promoter：正向: GGTTGTACGCGGTTAGGAGT；反向：GGCATGTTGCTAACTCATCG）。
3)?分析滴度。

5.?病毒表達檢測：
1)?HEK-293細胞按照2×105/ml重懸后鋪盤到12孔板中。
2)?24h后，選取兩個孔進行細胞計算。
3)?按照5,000 GC/cell準備AAV病毒（對照病毒以及Oct-4-IRES-ZsGreen重組腺相關病毒）：細胞數目×5,000 GC/100μl培養基。
4)?吸取12孔板中上清，加入100μl培養基。放入培養箱中培養90min，中途輕微晃動。90min后每孔加入900μl培養基，繼續培養48h。
5)?顯微鏡下觀察，拍照。

四、?實驗結果
?????????????????????????????????????????????????????????? 計算顯示Oct-4-IRES-ZsGreen重組腺相關病毒的滴度為6.1 X 1010 GC/ml (genome copies/ml).

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?????????????????????????????????????????????????? ?? 圖1. 對照病毒（左）以及Oct-4-IRES-ZsGreen重組腺相關病毒（右） 感染HEK-293細胞（5,000 GC/cell）
qPCR結果顯示，Oct-4-IRES-ZsGreen重組腺相關病毒的滴度達到6.1 X 1010 GC/ml (genome copies/ml) 。
在未添加腺病毒或其它促進表達的藥物的情況下，5000GC/ml的Oct-4-IRES-ZsGreen重組腺相關病毒感染HEK-293細胞48h，感染效率可以達到80%以上。
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五、?參考文獻
1.?Senapathy P, Carter BJ. Molecular cloning of adeno-associated virus variant genomes and generation of infectious virus by recombination in mammalian cells.J Biol Chem. 1984;7: 4661-4666.
2.?Wang L, Blouin V, Brument N, Bello-Roufai M,et al.Production and purification of recombinant adeno-associated vectors.Methods Mol Biol. 2011;807:361-404

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