Frdbio ?細胞凋亡檢測試劑盒(FITC/PI雙染法)

貨號：FrdE00018

試劑盒組分

?

一.產品說明

在正常細胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）只分布在細胞膜脂質雙層的內側，而在細胞凋亡早期，細胞膜中的磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內側翻向外側。Annexin V 是一種分子量為35~36kD 的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故

可通過細胞外側暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結合。因此Annexin V 被作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。將Annexin V 進行熒光素（FITC）標記，以標記了的Annexin V 作為熒光探針，利用熒光顯微鏡或流式細胞儀可檢測細胞凋亡的發生。

本試劑盒還提供了碘化丙啶染色液,碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但凋亡中晚期的 細胞和死細胞由于細胞膜通透性的增加，PI 能夠透過細胞膜而使細胞核染紅。因此將 Annexin V 與 PI 匹配使用，就可以將處于不同凋亡時期的細胞區分開來。

二.產品保存方法

各組分應在2-8℃條件下避光保存，有效期2年。

?

三.使用方法

1.?懸浮細胞離心（2000rpm 離心5min）收集；貼壁細胞用不含EDTA 的胰酶消化收集（注：胰酶消化時間不易過長，否則容易引起假陽性）；

2.?用PBS 洗滌細胞二次（2000rpm 離心5min）收集1-5×105?細胞；

3.?加入500μL 的Binding Buffer懸浮細胞；

4.?加入5μL Annexin V-FITC 混勻后，室溫避光，反應15-30min;

5.?用PBS 洗滌細胞一次（2000rpm 離心5min），500μL PBS 重懸細胞；

6.?加入 10 μL Propidium lodide；

7.?室溫，避光，孵育5min，上機檢測。

8.?注：請在1 hour 內，進行下述熒光顯微鏡或流式細胞儀的觀察和檢測。

a.?熒光顯微鏡觀察

1)?滴一滴上述染色后的細胞懸液于載玻片上，并用蓋玻片蓋上細胞；

2)?對于貼壁細胞來說，也可直接用蓋玻片來培養細胞并誘導細胞凋亡；

1?將細胞于蓋玻片上生長，用適當的凋亡誘導劑誘導細胞凋亡，并設立陰性對照組；

2?用PBS 洗滌細胞兩次；

3?在500μL 的Binding Buffer 中加入5μL Annexin V-FITC 和10ul Propidium lodide混勻；

4?將上述溶液滴加于蓋玻片表面，使蓋玻片表面均勻覆蓋；

5?避光、室溫反應5 min。

3)?將蓋玻片倒置于載玻片上，于熒光顯微鏡下濾光片（FITC）觀察，Annexin V-FITC 熒光信號呈綠色。

b.?流式細胞儀分析

1)?用流式細胞儀檢測，激發波長Ex=488 nm; 發射波長Em=525nm。Annexin V-FITC 的綠色熒光通過

FITC?通道（FL1）檢測。

?

四.注意事項

1.?微量試劑取用前請離心集液。

2. Annexin V-FITC?避光保存及使用。

3.?本試劑盒適用于檢測活細胞，流式細胞儀檢測時，細胞數量不應低于1×105，，不推薦用于檢測組織樣本。

4.?推薦使用懸浮培養細胞。如果是貼壁細胞，需用不含EDTA 的胰酶消化，如消化不當，可能引起假陽性，而用細胞刮子會造成細胞粘連成團，而影響檢測?？蓪⒁让赶蠹毎谋４嬖诤?%BSA 的PBS 中，防止進一步的損傷。

5.?細胞固定后可能導致熒光的淬滅，請不要固定樣品。

6.?因檢測細胞的類型、凋亡誘導劑種類、使用的檢測儀器不同，因而流式檢測的熒光補償也不同，因此建議每次檢測均需使用未經凋亡誘導處理的細胞作為對照，進行熒光補償的調節。

?

?

?

*本試劑僅供實驗室研究使用