端粒酶活性檢測(cè)試劑盒 50T
產(chǎn)品名稱： 端粒酶活性檢測(cè)試劑盒 50T
英文名稱： Telomerase activity assay kit
產(chǎn)品編號(hào)： BPT50
產(chǎn)品價(jià)格： 視規(guī)格
產(chǎn)品產(chǎn)地： 無(wú)錫馬山生命科學(xué)園
品牌商標(biāo)： biowing
更新時(shí)間： 2023-09-05T15:37:13
使用范圍： null
| 規(guī)格 | 價(jià)格 |
| BMP50 | 12500.0 |
- 聯(lián)系人 : 李丙卓
- 地址 : 上海市松江區(qū)中星創(chuàng)意園2號(hào)502
- 郵編 : 200233
- 所在區(qū)域 : 上海
- 電話 : 159****2595 點(diǎn)擊查看
- 傳真 : 點(diǎn)擊查看
- 郵箱 : libz@biowing.com.cn
端粒酶催化亞基TERT表達(dá)量檢測(cè)試劑盒(QPCR方法說(shuō)明書(shū))
【產(chǎn)品規(guī)格】
BPT50 50 T ( 50 人份，其中4個(gè)組分按5個(gè)10 人份獨(dú)立包裝 ，Biowing? Specific Reverse Transcription Primer按20 ul*2 獨(dú)立包裝 。)
【產(chǎn)品說(shuō)明】
端 粒酶 ( Telomerase?) 是一種酶促核糖核蛋 白復(fù)合物 。其催化亞基 ( TERT) 具有逆轉(zhuǎn)錄酶 的特性， TERT被認(rèn)為是端粒酶活性表達(dá)的關(guān)鍵組分， 其編碼的mRNA水平與端粒酶活性一致， 與端粒酶的活化程度密切相關(guān)。 因此， 對(duì)端粒酶催化亞基的檢測(cè)可以間接反映樣本中端粒酶活性。
本 產(chǎn) 品試劑盒采用雙色熒光qPCR?( TaqMan探針?lè)? 檢測(cè)端粒酶催化亞基TERT基 因和 內(nèi)參基 因GAPDH?。通過(guò)提取細(xì)胞RNA?， 利用特異性逆轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)， 以cDNA為模板在單管中利用多重?zé)晒舛縋CR進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng) ( 雙重探針： FAM?、Cy5?) 。選用293?T細(xì)胞為陽(yáng)性對(duì)照
以及MRC- 5?細(xì)胞為陰性對(duì)照， 判斷樣本中是否有TERT基因表達(dá) 。該試劑盒具有以下特點(diǎn)：
1?. 靈敏：雙色探針，靈敏度高。
2?. 穩(wěn)定：全程閉管操作，無(wú)交叉污染。
3?. 可靠：含內(nèi)參基因，避免假陰性。
4?. 方便：操作簡(jiǎn)單，無(wú)需電泳步驟。
5. 定量： 以CT值判斷，可定量檢測(cè)。
【運(yùn)輸及保存條件】
低溫冷凍運(yùn)輸 ， 避光-20?℃保存 ， 有效期6?個(gè)月。開(kāi)蓋后，4℃保存，有效期1周。
【產(chǎn)品組分】
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組分名稱 |
BPT50 |
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Biowing??Specific?Reverse?Transcription?Primer |
20ul*2 |
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Biowing??Probe?qPCR?SuperMix |
402ul*5 |
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Positive?Control?(293T?cell’s?cDNA) |
10ul*5 |
|
Negative?Control?(MRC-?5?cell’s?cDNA) |
10ul*5 |
|
RNase?Free?Water |
200ul*5 |
注： 1. 本試劑盒提供試劑，使用前先低速離心、后小心開(kāi)啟。使用時(shí)請(qǐng)上下輕柔顛倒十次混勻，避免起泡，并低速短暫離心后使用；2.為了避免反復(fù)凍融，10 人份/管作為一個(gè)包裝。
【操作步驟】
1. 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
使用Trizol法抽提細(xì)胞RNA?， RNA純度A260?/ 280?在1 .9?-2?. 0?之間 。取1?ug?RNA使用Thermo逆轉(zhuǎn)錄試劑 盒 ( 貨 號(hào) ： K1622 ) ， 將 試 劑 盒 中 的 Random Primer 替 換 成 Biowing? Specific Reverse?Transcription?Primers進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA。
1.?1?DNase?I處理
|
RNA?(μg) |
DNase?Buffer?(μL) |
DNase?Ⅰ(?μL) |
DEPC?水(μL) |
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1 |
1 |
1 |
To?10 |
反應(yīng)程序：37℃ 30min?；加 EDTA?1?μL?后，65℃ , 10min
1.2?逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
|
RNA(?μL) |
Biowing??Specific?Reverse?Transcription?Primers(?μL) |
5?×Buffer?(?μL) |
RT(?μL) |
RI(?μL) |
dNTP(?μL) |
|
5.5 |
0.5 |
2 |
0.5 |
0.5 |
1 |
反應(yīng)程序：20℃ 10min?；42℃ 1h；72℃ 5min
2.?qPCR反應(yīng)體系及條件
2.?1?陽(yáng)性對(duì)照處理
將陽(yáng)性對(duì)照cDNA進(jìn)行4?倍、8?倍的梯度稀釋， 每個(gè)梯度建議三重復(fù)。
2.2?陰性對(duì)照處理
將陰性對(duì)照cDNA進(jìn)行4?倍、8?倍的梯度稀釋， 每個(gè)梯度建議三重復(fù)。
2.3?樣本處理
將待測(cè)樣本cDNA進(jìn)行4 倍稀釋作為測(cè)試濃度， 每個(gè)樣本做三重復(fù)。反應(yīng)體系 (以20μL為例)
PCR儀設(shè)置 (以ABI?7500為例) ?
【基線設(shè)置】 (以ABI?7500為例)
一般默認(rèn)起始和終止基線位置為3?- 15?個(gè)循環(huán)， 應(yīng)根據(jù)內(nèi)參基因和TERT基因?qū)嶋H擴(kuò)增曲線手動(dòng)將基線起始循環(huán)數(shù)調(diào)整為指數(shù)增長(zhǎng)期之前即可。
【閾值設(shè)置】 (以ABI?7500為例)
內(nèi)參閾值設(shè)定： 以陽(yáng)性對(duì)照4倍稀釋cDNA定內(nèi)參基因擴(kuò)增曲線閾值， 內(nèi)參基因(Cy5) 初始濃度的CT值定為17±3；
TERT閾值設(shè)定： 以陽(yáng)性對(duì)照4?倍稀釋cDNA定TERT基因擴(kuò)增曲線閾值， TERT基因( FAM) 初始濃度CT值的定為25±3。
【結(jié)果判讀】
1.?陽(yáng)性對(duì)照4倍稀釋后TERT基因Ct值在25±3?， 內(nèi)參基因Ct值在17±3?，8倍稀釋后TERT基因Ct值在26±3， 內(nèi)參基因Ct值在18±3?。TERT基因和內(nèi)參基因之間?CT維持在9±3?，保持穩(wěn)定。
2?. 陰性對(duì)照經(jīng)4倍、8倍梯度稀釋后，TERT基因Ct值≥35???(或檢測(cè)不到) ， 內(nèi)參基因Ct值仍在18±3之間，?判定為端粒酶活性為陰性。
3. 結(jié)果說(shuō)明
若待測(cè)樣本內(nèi)參基因Ct值在17?±3之間， TERT基因Ct值＜35?且擴(kuò)增曲線正常， 則樣本端粒酶活性為陽(yáng)性。
若待測(cè)樣本內(nèi)參基因Ct值在17?± 3?之間， TERT基因Ct值≥35?且無(wú)明顯的擴(kuò)增曲線則樣本無(wú)端粒酶活性。
【說(shuō)明】
1?. 待測(cè)樣本cDNA?4倍稀釋作為模板， 三次技術(shù)重復(fù)，不設(shè)置梯度稀釋； 陽(yáng)性對(duì)照、 陰性對(duì)照進(jìn)行4?倍、8倍梯度稀釋，建議分別做三重復(fù)；避免偶然誤差的產(chǎn)生。
2.?如果陽(yáng)性/陰性對(duì)照4倍稀釋后內(nèi)參基因Ct值＞20?，表明參考品有降解或者試劑盒擴(kuò)增效率下降。
3.?如果所有樣本4倍稀釋后內(nèi)參基因Ct值＞20?，表明試劑盒的擴(kuò)增效率下降。
4.?如果陽(yáng)性對(duì)照4倍稀釋后TERT基因Ct值＞28?，表明TERT基因檢測(cè)系統(tǒng)失效。
如有技術(shù)問(wèn)題，請(qǐng)電話咨詢：021-33559491。
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