產品簡介

TUNEL FITC 凋亡檢測試劑盒主要用來檢測組織細胞在凋亡晚期過程中細胞核 DNA 的斷裂情況。細胞在發 生凋亡時 ，會激活一些 DNA 內切酶 ，這些內切酶會切斷核小體間的基因組 DNA ，此時抽提 DNA 進行電泳 檢測 ，可以發現 180-200 bp 的 DNA ladder。在末端脫氧核糖核苷酸轉移酶（TdT） 的作用下 ，在基因組  DNA 斷裂時暴露出的 3 ´-羥基（3 ´-OH）末端摻入 FITC-12-dUTP ，從而可以用熒光顯微鏡或流式細胞儀   檢測細胞的凋亡情況。

本試劑盒對該標記反應進行了優化，采用最適宜比例的 FITC-12-dUTP 和未標記 dNTP 進行 3 ´-OH 末端的 核苷酸摻入，使得同一個斷裂的 DNA 片段末端可以形成更長的“標記尾巴”，減少了相鄰摻入 dNTP 上標 記基團的空間位阻 ，增加每個斷裂片段上的熒光基團數目 ，降低熒光基團相鄰后可能造成的聚集和淬滅 ， 從而提高檢測靈敏度 ，減少非特異性反應。本試劑盒可以用于檢測冷凍或石蠟切片中的細胞凋亡情況 ，也 可以檢測培養的貼壁細胞或懸浮細胞的凋亡情況。

組分信息

儲存條件

冰袋（wet ice）運輸。本試劑盒儲存在-20℃ ,  FITC-12-dUTP Labling Mix 避光儲存于-20℃ ,  保質期為二年。

注意事項

1.     需自備用于洗滌細胞的 PBS ，用于封片的抗熒光淬滅封片液 ，用于固定的 4%多聚甲醛。

2.     如需染核 ，需自備 DAPI（2 μg/mL）或 PI（1 μg/mL）。

3.     如果用流式細胞儀 ， 自備 PI（1 μg/mL）和 DNase Free RNase A。

4.     為了您的安全和健康 ，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

5.     本產品僅用于科研。

使用說明

一、樣品準備

A.     石蠟包埋組織切片

1.     室溫下將石蠟組織切片放入二甲苯中浸泡 5 min ，重復一次 ，以徹底脫掉石蠟。

2.     室溫下用 100%乙醇浸泡切片 5 min ，重復一次。

3.     室溫下用梯度乙醇（90、80、70%）各浸洗 1 次 ，每次 3 min。

4.     用 PBS 輕輕潤洗切片 ，并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余的液體。這時 ，可用石蠟筆或疏水筆  在樣品周圍描繪樣品分布的輪廓，便于下游透性處理和平衡標記操作。在實驗過程中，切勿讓樣品干 燥 ，處理好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤。

5.     配制 Proteinase K 工作液：按 1:100 的比例 ，用 PBS 作為稀釋液來稀釋 2 mg/mL 的 Proteinase K 溶液 ，使其終濃度為 20 μg/mL。

6.     每個樣本上滴加 100 μL 上述 Proteinase K 工作液 ，使其被全部覆蓋 ，室溫孵育 20 min。

7.     注：Proteinase K 幫助組織和細胞對后續步驟的染色試劑通透。孵育時間過長會增加組織切片在后續 洗滌步驟中從載波片上脫落的風險，過短則可能造成透性處理不充分，影響標記效率。未得到更好的 結果 ，可能需要優化 Proteinase K 孵育的時間。

8.     用 PBS 溶液潤洗樣本 ，輕輕去掉多余液體 ，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體。處理后的 樣本放在濕盒中保存樣本的濕潤。

B.    組織冰凍切片

1.     將玻片浸沒在 4%多聚甲醛溶液（溶于 PBS） 中固定 ，室溫下孵育 15 min。

2.     輕輕去掉多余液體 ，并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余的液體。

3.     將玻片浸沒在 PBS 溶液中 ，室溫孵育 15 min。

4.     輕輕去掉多余液體 ，并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余的液體。這時 ，可用石蠟筆或疏水筆在樣 品周圍描繪樣品分布的輪廓 ，便于下游透性處理和平衡標記操作。在實驗過程中 ，切勿讓樣品干燥， 處理好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤。

5.     配制 Proteinase K 工作液：按 1:100 的比例 ，用 PBS 作為稀釋液來稀釋 2 mg/mL 的 Proteinase K 溶液 ，使其終濃度為 20 μg/mL。

6.     每個樣本上滴加 100 μL 上述 Proteinase K 工作液 ，使其被全部覆蓋 ，室溫孵育 10 min。

【注】 Proteinase K 幫助組織和細胞對后續步驟的染色試劑通透。孵育時間過長會增加組織切片在后續洗 滌步驟中從載波片上脫落的風險 ，過短則可能造成透性處理不充分 ，影響標記效率。未得到更好的結果 ， 可能需要優化 Proteinase K 孵育的時間。

7.     用 PBS 溶液潤洗樣本 2-3 次。

8.     輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體。處理后的樣本放在濕盒中保存樣本 的濕潤。

C.    細胞樣品

【細胞爬片的準備】

1. 在 Lab-Tek 載玻片小室（Chamber Slides）上培養貼壁細胞。在凋亡誘導處理之后 ，用 PBS 洗 2 遍 載玻片。

【細胞涂片的制備（以多聚賴氨酸包被的載玻片為例）】

1. 準備多聚賴氨酸包被的載玻片：吸取 50–100 μL 0.01% (w/v)多聚賴氨酸水溶液 ，滴至每一片預清洗 過的玻璃載玻片的表面。在將要用于固定細胞的區域將多聚賴氨酸溶液涂散為一薄層。待載玻片晾干之后 ，迅速用去離子水漂洗 ，然后讓包被后的載玻片在空氣中晾干 30-60 min。包被后的載玻片能在 室溫儲存數月。

2. 以約 2×10⁷個細胞/mL 的濃度將細胞重懸于 PBS 中 ，吸取 50-100 μL 細胞懸液滴于多聚賴氨酸包被的載玻片上 ，用一片干凈的載玻片輕柔的涂開細胞懸液。

按照以下步驟對細胞樣品進行處理：

1. 固定細胞 ，將載玻片浸入裝有 4%新鮮配制于 PBS 中的多聚甲醛的染色缸中 ，在 4℃放置 25 min。

2. 洗滌載玻片 ，將其浸入 PBS 中 ，室溫放置 5 min。重復用 PBS 洗一次。

3. 輕輕去掉多余液體 ，并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余的液體。這時 ，可用石蠟筆或指甲油在樣 品周圍描繪樣品分布的輪廓 ，便于下游透性處理和平衡標記操作。在實驗過程中 ，切勿讓樣品干燥， 處理好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤。

4. 每個樣本上可浸于 0.2%配制于 PBS 中的 Triton X-100 溶液中，室溫孵育 5 min 進行通透處理（Protein ase K 處理容易使細胞脫落）。

5. 在盛有 PBS 溶液的敞口燒杯中浸沒清洗樣本 2-3 次。

6. 輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體。處理后的樣本放在濕盒中保存樣本 的濕潤。

二、DNA 酶處理陽性對照的步驟（可選） 

1. 在樣本通透處理后，用 DNA 酶 I 處理細胞來準備陽性對照載玻片。該流程通常會引起被處理的大多數 細胞顯現綠色熒光。

【注】 DNA 酶 I 處理固定的細胞會引起染色體 DNA 的斷裂 ，產生許多可標記的 DNA 3’-末端。

2. 按 1:10 的比例用去離子水稀釋 10×DNase I Buffer(每個樣本需用 200 μL 1×DNase I Buffer，即需  要用 20 μL 10×DNase I Buffer 和 180 μL 去離子水混合稀釋) ，取其中100 μL滴加到已通透的樣本上 ，室溫孵育 5 min。  向剩余 100 μL 1×DNase I Buffer 中加 1 μL DNase I (1U/μL) ，使其終濃度為10 U/mL。

3. 輕輕叩掉液體 ，加入100 μL含 10 U/mL DNase I  的緩沖液 ，室溫孵育 10 min。

4. 輕叩載玻片 ，去掉多余的液體 ，并將載玻片在裝有去離子水的染色缸中徹底洗 3-4 次。

【注】 陽性對照載玻片必須使用單獨的染色缸 ，否則陽性對照載玻片上殘余的 DNase I  可能會在實驗載玻 片上引入高背景。

三、標記與檢測

1. 按 1:5 的比例用去離子水稀釋 5×Equilibration Buffer。

2. 每個樣本滴加 100 μL 1×Equilibration Buffer 使其全部覆蓋待檢樣本區域，室溫孵育 10-30 min?；蛘邔⑤d玻片放入一個含有  1×Equilibration Buffer 的缸中 ，保證緩沖液沒過樣本。在平衡細胞的同  時在冰上解凍 FITC-12-dUTP Labling Mix，并且依照表 1，準備足夠量的用于所有實驗的和可選陽性 對照反應的 TdT 孵育緩沖液。對于面積小于 5 cm2 的一個標準反應 ，其體積是 50 μL，用 50 μL 乘以 實驗和陽性對照反應的數目來確定所需 TdT 孵育緩沖液的總體積。對于表面積更大的樣本，可成比例 的增大試劑體積。

表 1. 準備用于實驗的和可選陽性對照反應的 TdT 孵育緩沖液

陰性對照體系：準備一份不含 TdT 酶的對照孵育緩沖液 ，用 ddH₂O 替代 TdT 酶。

3. 在平衡后的區域周圍用吸水紙洗掉 100 μL 1×Equilibration Buffer 中的大部分 ，然后在 5 cm2 面積 的細胞上加入 50 μLTdT 孵育緩沖液。不要讓細胞干掉。這之后的操作 ，載玻片要避光。

4. 把塑料蓋玻片蓋在細胞上以保證試劑的平均分布，在濕盒的底部放上用水浸濕的紙巾。將載玻片置于 濕盒內 ，在 37℃孵育 60 min。將濕盒用鋁箔紙包裹以避光。

注：塑料蓋玻片在使用前可以切成兩半。折起蓋玻片的邊緣以便于移除和操作。

5. 移除塑料蓋玻片 ，并將切片置于 PBS 溶液中室溫孵育 5 min。

6. 輕輕去掉多余液體 ，換用新鮮的 PBS 溶液室溫孵育 5 min ，重復一次。

7. 用濾紙輕輕擦掉樣本周圍及背面的 PBS 溶液。注意：為了降低背景 ，載玻片在用 PBS 洗一遍后 ，可 再用含 0.1% Triton X-100 和 5 mg/mL BSA 的 PBS 洗 3 次 ，每次 5 min ，這樣可將游離的未反應標 記物清除干凈。

8. 樣本在染色缸中染色 ，在黑暗中將載玻片浸入裝有 PI 溶液（1 μg/mL ，用 PBS 新鮮配制并稀釋） 的 染色缸 ，室溫放置 5 min。可選操作：樣本在染色缸中染色 ，在黑暗中將載玻片浸入裝有 DAPI 溶液 （2 μg/mL ，用 PBS 新鮮配制并稀釋）的染色缸 ，室溫放置 5 min。

9. 洗滌樣本 ，將載玻片浸入去離子水中 ，室溫放置 5 min ，重復 2 次 ，總共洗 3 次。

10. 叩干載玻片上多余的水并且用吸水紙擦拭細胞周邊的區域。

11. 立即在熒光顯微鏡下分析樣本，用標準的熒光過濾裝置在 520±20 nm 的熒光下觀察綠色熒光；在＞620 nm 下觀察 PI 的紅色熒光 ，或在 460 nm 觀察藍色的 DAPI。如有必要 ，載玻片能在 4℃黑暗條 件下存放過夜。PI/DAPI 能將凋亡和未凋亡的細胞都染成紅色/藍色 ，只在凋亡的細胞核中才有FITC-12-dUTP 摻入而定位的綠色熒光。

四、利用流式細胞術檢測懸浮細胞

1. 將 3-5×10⁶個細胞用 PBS 在 4℃離心（300×g）洗兩次 ，然后重懸在 0.5 mL PBS 中。

2. 固定細胞 ，加入 5 mL 1%配制于 PBS 中的多聚甲醛溶液 ，冰上放置 20 min。

3. 細胞在 4℃ ,  300×g 離心 10 min ，去上清并且重懸于 5mL PBS。重復洗一次 ，并用 0.5 mL PBS 重 懸細胞。

4. 通透細胞，加入 5 mL 冰上預冷的 70%乙醇，在-20℃孵育 4 小時。細胞能在 70%乙醇中-20℃條件下保存一周 ，或者 ，細胞可用配制于 PBS 中的 0.2% Triton X-100 溶液通透 ，室溫放置 5 min。