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? ? ? ? ? ?人肝癌細(xì)胞

（Hep G2）

細(xì)胞介紹

該細(xì)胞系來自15歲男性白人的組織。形態(tài)為上皮形，模式染色體數(shù)為55，在免疫抑制小鼠中不致瘤。

細(xì)胞特性

1）?來源：肝細(xì)胞癌

2）?形態(tài)：上皮細(xì)胞樣，貼壁生長

3）?含量：>1x10^6??細(xì)胞數(shù)

4）?規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

5)??用途：僅供科研使用。

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運(yùn)輸和保存：干冰運(yùn)輸及復(fù)蘇好存活細(xì)胞：（1）1mL凍存管包裝干冰運(yùn)輸，收到后-80度冰箱保存過夜后轉(zhuǎn)入液氮或直接復(fù)蘇，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染，請立即與我們聯(lián)系。（2）T25瓶復(fù)蘇的存活細(xì)胞常溫發(fā)貨，收到后按照細(xì)胞接收后的處理方法操作。

細(xì)胞接收后的處理：

1）收到細(xì)胞后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損、有液溢出及細(xì)胞有污染，請拍照后及時(shí)聯(lián)系我們。?

2）請?jiān)?/font>4或5X顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞狀態(tài)，同時(shí)給剛收到的細(xì)胞拍照（10×，20×）各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存，作為售后時(shí)收到時(shí)細(xì)胞狀態(tài)的依據(jù)。

3）貼壁細(xì)胞：細(xì)胞在37℃培養(yǎng)箱中放置2-3h，顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長和貼壁情況，有些貼壁細(xì)胞在快遞運(yùn)送過程中會(huì)因振動(dòng)脫落和脫落后成團(tuán)的情況。若鏡下觀察細(xì)胞的生長密度若在60%以下，可去除培養(yǎng)瓶中灌液培養(yǎng)基（若有未貼壁的細(xì)胞需要離心回收，重懸打入到原培養(yǎng)瓶中）,加入新配制的完全培養(yǎng)基6-8mL，放到細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。若細(xì)胞生長密度達(dá)70%-80%以上，可以對細(xì)胞進(jìn)行傳代處理。傳代過程中，若因運(yùn)輸振動(dòng)脫落的細(xì)胞需要離心回收。

4）備注：運(yùn)輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來培養(yǎng)細(xì)胞，請換用按照說明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的完全培養(yǎng)基來培養(yǎng)細(xì)胞。??收到細(xì)胞后第一次傳代建議T25培養(yǎng)瓶1：2傳代 。?

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一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1）?準(zhǔn)備MEM（推薦iCell-0012）培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2）?培養(yǎng)條件：?氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

培養(yǎng)注意事項(xiàng)：1.?hepg2細(xì)胞復(fù)蘇或傳代后會(huì)有少部分的細(xì)胞貼壁和部分懸浮的細(xì)胞，復(fù)蘇兩天后細(xì)胞會(huì)從貼壁細(xì)胞向外開始生長，有時(shí)細(xì)胞再生長過程中，細(xì)胞會(huì)再貼壁細(xì)胞的上方生長，形成不同的細(xì)胞層，這種情況會(huì)有發(fā)生。 在細(xì)胞復(fù)蘇的一周內(nèi)，培養(yǎng)瓶中 通常會(huì)有懸浮的活的細(xì)胞團(tuán)，在換液過程中不要丟棄在這些活的懸浮細(xì)胞，可以通過離心（125×g）回收細(xì)胞，重新打回到培養(yǎng)瓶中，分離或者丟棄漂浮的活細(xì)胞會(huì)使細(xì)胞數(shù)量變少，引起細(xì)胞的停滯生長或細(xì)胞死亡。

2.培養(yǎng)條件的細(xì)微變化，尤其是pH和培養(yǎng)基中血清的質(zhì)量，可能會(huì)影響細(xì)胞的生長狀況，在細(xì)胞的生長過程中會(huì)有細(xì)胞內(nèi)的液泡出現(xiàn)，特別在細(xì)胞快要融合是會(huì)出現(xiàn)這種情況。培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)使用未被滅活的高質(zhì)量、低內(nèi)毒素的胎牛血清，可以使細(xì)胞更好的貼壁和形成單層細(xì)胞。

3.?細(xì)胞在生長過程中可以通過將血清濃度提到到20%來改善細(xì)胞生長緩慢的情況。（參考atcc?有關(guān)該細(xì)胞的描述）

3）?凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

二．?細(xì)胞處理：

1）凍存細(xì)胞的復(fù)蘇：

將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。然后將細(xì)胞懸液加入含6-8ml完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過夜。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況和細(xì)胞密度。

2）?細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)70%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

該細(xì)胞為輕微貼壁和少量懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，傳代可以參考以下方法：

1.?收集：將培養(yǎng)瓶中的懸浮的細(xì)胞收集到離心管中。用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。由于細(xì)胞貼壁不牢PBS潤洗后細(xì)胞會(huì)脫落所以PBS也要回收到離心管中。

2.?加入0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL）置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細(xì)胞可以適當(dāng)延長消化時(shí)間），然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化。

3.?將收集到的懸浮細(xì)胞、pbs清洗液中的細(xì)胞和消化下來的貼壁細(xì)胞以1000rpml離心5min，棄去上清，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后重懸混勻后將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的完全培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長活力，后續(xù)傳代根據(jù)實(shí)際情況按1:2~1:5的比例進(jìn)行。

3）?細(xì)胞凍存:?收到細(xì)胞后建議在培養(yǎng)前3代時(shí)凍存一批細(xì)胞種子以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。下面T25瓶為例；

1.?細(xì)胞凍存時(shí)按照細(xì)胞傳代的過程收集消化好的細(xì)胞到離心管中，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，來決定細(xì)胞的凍存密度。一般細(xì)胞的推薦凍存密度為1×10⁶~1×10⁷個(gè)活細(xì)胞/ml.