貨號：D1120?

規格：50T/100T??

保存：RNase?A，溶菌酶于-20?℃保存，其它試劑室溫保存。復檢期一年。

產品內容：

注意：使用前請先在漂洗液中加入無水乙醇，加入體積請參照瓶體上的標簽。溶液Ⅰ在使用前先加入RNaseA（將試劑盒中提供的?RNaseA?全部加入），混勻，置于?2-8℃保存。所有離心步驟均為使用臺式離心機在室溫下離心。

操作步驟：?

1、取1-5ml?細菌培養物，12000rpm離心1min，盡量吸除上清（菌液較多時可以通過多次離心將菌體沉淀收集到一個離心管中）。?

2、向留有菌體沉淀的離心管中加入200ul?溶液Ⅰ(請先檢查是否已加入RNaseA）,?使用移液器或旋渦振蕩器徹底懸浮細菌細胞沉淀。再向其中加入50ul?溶菌酶，混勻。37℃水浴30?min?以上（根據菌液量可適當加長水浴時間）。注意：如果菌塊未徹底混勻，會影響裂解導致質粒提取量和純度偏低。如不能確定為何種菌，請按陽性菌處理。?

3、向離心管中加入?250ul?溶液Ⅱ，溫和地上下翻轉?6-8?次使菌體充分裂解。注意：混勻一定要溫和，以免污染基因組DNA，此時菌液應變得清亮粘稠，作用時間不要超過5?min，以免質粒受到破壞。?

4、向離心管中加入?350ul?溶液Ⅲ，立即溫和地上下翻轉?6-8?次，充分混勻，此時會出現白色絮狀沉淀。12000rpm離心10?min?。注意：溶液Ⅲ加入后應立即混勻，避免產生局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。?

5、將上一步所得上清液加入吸附柱中（吸附柱加入收集管中），室溫放置2min，12000rpm?離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中(?如果一次加不完，可分兩次吸附)?。?

6、向吸附柱中加入600ul?漂洗液（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇）?，12000rpm離心1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。?

7、向吸附柱中加入600ul?漂洗液，12000rpm離心1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。?

8、12000rpm離心2min，將吸附柱敞口置于室溫或?50℃溫箱放置數分鐘，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，否則漂洗液中的乙醇會影響后續實驗如酶切、PCR?等。?

9、將吸附柱放入一個干凈的離心管中，向吸附膜中央懸空滴加?50-200ul?經65℃水浴預熱的洗脫液，室溫放置2min，12000rpm離心1min，收集質粒DNA溶液。?

10、（可選）為了增加質粒的回收率，可將得到的洗脫液重新加入吸附柱中，室溫放置2min，12000rpm離心1min。?

注意事項：?

1、使用前請先檢查溶液Ⅱ和溶液Ⅲ是否出現混濁，如有混濁現象，可在?37℃水浴中加熱幾分鐘，待溶液恢復澄清后再使用。?

2、洗脫緩沖液體積不應少于50ul，體積過小影響回收效率；洗脫液的pH?值對洗脫效率也有影響，若需要用水做洗脫液應保證其?pH值在8.0左右(?可用NaOH?將水的pH值調至此范圍)?，pH值低于7.0會降低洗脫效率。DNA產物應保存在-20?℃，以防DNA降解。?

3、如果所提質粒為低拷貝質粒或大于?10kb的大質粒，應加大菌體使用量，使用5-10ml過夜培養物，同時按照比例增加溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的用量，吸附和洗脫時可以適當的延長時間，以增加提取效率。?

4、DNA濃度及純度檢測：得到的質粒DNA純度與樣品保存時間、操作過程中的剪切力等因素有關。得到的DNA可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度。DNA應在OD260處有顯著吸收峰，OD260值為1?相當于大約50?μg/ml?雙鏈DNA、40?μg/ml?單鏈DNA。OD260/OD280比值應為1.7-1.9?，如果洗脫時不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水，比值會偏低，因為pH值和離子存在會影響光吸收值，但并不表示純度低。

相關產品：