產品說明
本比色分析試劑盒是基于孔雀綠、鉬酸鹽和自由磷酸根離子形成綠色復合物測定自由磷酸根離子含量。該反應快速、靈敏、可用分光光度計(600?–?660nm)或酶標儀方便地測量。試劑適用于試管、比色皿或多孔板(96或384孔板)。
產品特點
試劑穩定性高：由于我們的創新配方，試劑沒有沉淀析出，因此測試前不需預先過濾試劑。
高靈敏性：檢測范圍0.02?-?40?mM?磷酸根。
快速和方便：均相法只需混合和測量，20分鐘內量可完成檢測。
兼容性高：試劑適用于試管、比色皿、96或384多孔板，分光光度儀或酶標儀上讀數。
重復性高：在96/384孔板上Z’因子為0.7-0.9，易于自動化作高通量藥物篩選。
產品用途
磷酸酶檢測：從肽、蛋白質或小分子底物中釋放的磷酸磷酸根離子。
脂肪酶檢測：從磷脂中釋放的磷酸根離子。
核苷三磷酸酶檢測：從核苷三磷酸(ATP,?GTP,?TTP,?CTP等)中釋放的磷酸根離子。
磷酸根定量測定：存在于磷脂、蛋白質和DNA等物質中的磷酸根。
藥物開發：高通量篩選磷酸酶抑制劑。
試劑盒組成：用96孔板可做2500次測試
試劑A：50?mL?????試劑B：1?mL???標準液：1?mL?1?mM磷酸鹽
儲藏條件：4°C下保存，保質期一年。
預防措施：本產品僅供研究用。使用過程中嚴格遵循實驗安全措施。
96孔板法測試步驟
制備足夠量的工作試劑：將試劑放置至室溫。?混合100?vol試劑A和1?vol?試劑B(如：5?mL試劑A和50?mL試劑B)。每個檢測需20mL工作試劑。工作試劑可在常溫下保存一天。
注意：檢測前，確保所有酶和緩沖液不含磷酸鹽。將20mL工作試劑與80mL酶/緩沖液混合，620nm處OD值應該低于0.2；如果OD值超過0.2，則水或所用試劑中可能含過量的磷酸鹽。
1、磷酸根標準：混合40μL?1mM的標準液和960μL蒸餾水得到40?μM的磷酸鹽標準液。按照下表稀釋標準液，轉移80mL標準液到平底透明的96孔板的不同孔中。
No
Premix?+?H2O
Final?Vol?????(mL)
Phosphate
Conc?(mM)
pmoles?Phosphate
in?50?mL
1
200mL?+???0mL
200
40
2,000
2
160mL?+??40mL
200
32
1,600
3
120mL?+??80mL
200
24
1,200
4
??mL?+?120mL
200
16
??800
5
??60mL?+?140mL
200
12
??600
6
??40mL?+?160mL
200
??8
??400
7
??20mL?+?180mL
200
??4
??200
8
????0mL+200mL
200
??0
?????0
2、轉移80mL樣品到平, 板的不同孔中。
注意：對ATP酶/GTP酶反應，ATP和GTP的濃度應<?0.25mM。如果ATP或GTP濃度>0.25mM，用蒸餾水稀釋(比如，ATP酶反應物含有1?mM?ATP，檢測前加入4倍的水稀釋反應混合物)。
3、在每個孔中加入20μL工作試劑。輕敲平板將試劑混合均勻。注意：工作試劑會終止酶反應。
4、在室溫下反應30分鐘，顏色變深。
5、記錄600-660nm?(620nm)吸光值。
注意事項
比色皿檢測：步驟和96孔板檢測步驟一樣。不同的是，標準液和樣品的量是800μL，工作試劑200μL。
384孔板檢測：標準液和樣品的量是40μL，工作試劑10μL。
沉淀：磷酸鹽濃度很高(>100?mM)?或蛋白質和金屬含量高時會發生沉淀。如果出現沉淀，用水稀釋樣品，直到不會出現沉淀，用稀釋的樣品重復測試，結果乘以稀釋倍數。
酶反應：由于任何外來的磷酸鹽會干擾測試，確保酶準備過程中和緩沖液所用試劑不含磷酸鹽。
液體處理：檢測混合液含有0.4M硫酸，可用等量的NaOH中和廢液。
數據分析
繪制標準曲線，通過標準曲線測定樣品中磷酸鹽的濃度。
論文發表
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