產品簡介：

單克隆抗體序列可變區獲取和序列測定是基因工程抗體的關鍵步驟，但是由于抗體基因序列5’端復雜性和多樣性，往往獲取可變區序列比較困難，5’-RACE雖然可以實現，但是成本高，操作復雜，由于抗體序列的復雜性和SP2/0基因組干擾序列太多，RACE往往不是最優的手段；本試劑盒通過優化設計,采用高效引物Mix組合覆蓋，經過兩輪PCR擴增，可以快速簡便擴增出抗體基因可變區序列，擴增獲得的序列連接至T載體，通過簡單測序，可以快速得到抗體可變區序列，后期用于基因工程抗體的改造表達。

之前版本試劑盒配置了RT反轉錄Mix，鑒于很多實驗室對于mRNA提取和反轉錄技術已經相當成熟，因此本簡版試劑盒只提供最核心的PCR擴增試劑，這樣大大節約了實驗者的科研成本。

本試劑盒的優勢：

1.   操作時間短，如果操作順利，3-5工作日內可以獲取到抗體可變區序列；

2.   本試劑盒操作簡單，具備基本分子生物學操作基礎的人可以輕松入手實現操作；

3.  本試劑盒可以剔除和降低基因組或者相似序列對序列準確度的影響；

4.   實驗室內實現抗體基因測序，成本更低：目前委托技術服務公司進行雜交瘤測序費用較高；

5.   實驗室內實現抗體基因測序，更有利于抗體序列的核心知識產權和專利的保護。

特別注意事項：

1.   本試劑盒適用于單抗輕鏈為Kappa亞型細胞株，如果輕鏈Lambda請聯系購買另外產品。

2.   本試劑盒的操作人員必須熟練掌握分子生物學相關實驗操作技能，包括mRNA提取，反轉錄，PCR擴增， PCR產物膠回收，T載體連接，大腸桿菌轉化，菌落PCR鑒定 ，以及測序結果的分析解讀和序列比對等技能；

3.   實驗室必須具備開展以上實驗所必須的實驗儀器和實驗條件；

4.   實驗室必須具備開展以上實驗所必須的高性能試劑；

5.   務必保證雜交瘤細胞株為單克隆，狀態好，傳代培養越少越好；

6.   實驗室環境必須潔凈，實驗人員操作規范，避免交叉污染。

試劑盒組分

雜交瘤可變區基因片段擴增基本流程：

流程包括以下環節：mRNA提取→反轉錄→1^st PCR和2^ndPCR擴增→PCR產物膠回收→T載體連接→大腸桿菌轉化→菌落PCR鑒定→測序結果識讀→序列比對/抗體序列分析→抗體重組表達

1.實驗準備

1）為確保實驗能夠順利開展，請確保您已經掌握試劑盒操作流程中各環節所需的技能:

2）必備儀器：PCR儀，水平電泳儀，高速離心機

3）其他需要您準備的試劑：RNA提取試劑盒/Trizol試劑(氯仿，75% 乙醇，無RNase ddH₂O, 異丙醇)，高品質mRNA反轉錄試劑（盒），T-載體連接試劑盒，DNA凝膠回收試劑盒，ddH₂O(無RNase）等

4）必備耗材：吸頭/EP管(無RNase）

2.實驗操作

1）雜交瘤細胞mRNA提取

（1）培養雜交瘤細胞

首先確保你的雜交瘤細胞株是單克隆，雜交瘤細胞株培養至細胞數約 1.0×10⁵-1.0×10⁶（例如，24孔板中1-2個長滿孔的細胞量）時，將細胞吹起重懸，1500rpm x 5min， 離心收集細胞；同時收集細胞培養上清用于鑒定單克隆抗體雜交瘤細胞分泌抗體的亞型。

（2）單抗亞型及輕鏈測定

步驟1收集的細胞培養上清，通過ELISA方法測定抗體亞型（如果之前已經完成亞型和輕鏈鑒定,此處不必再測），亞型測定不方便的,可以購買我們的亞型測定試劑盒。

（3）雜交瘤細胞mRNA的提取

以下步驟僅供參考，強烈建議:使用高品質RNA提取試劑盒并消化掉基因組DNA

1步驟（1）得到細胞離心沉淀，盡量吸干殘余液體；在超凈工作臺環境，向細胞沉淀中加入1ml Trizol裂解液，充分裂解細胞，靜置5min；

2加入200uL氯仿，劇烈震蕩30秒，室溫靜置3min，12000 rpm  15 min；

3取上層水樣層至新的EP管，加入等體積異丙醇，室溫靜置30分鐘或-20℃ 放1-2小時；

412000 rpm  10 min，棄上清，管底白色沉淀物即為RNA;

5加入1 mL 75% 乙醇重懸洗滌RNA，12000rpm  10 min，小心吸棄液體，在超凈臺內風干管底沉淀；

6加入50ul 無RNase ddH₂O復溶（如果難以溶解，請置于55℃至完全溶解），即得到mRNA,立即進行反轉錄步驟，或者-80℃保存備用。

2）RT反轉錄

上述步驟得到的mRNA立即進行cDNA反轉錄。

選用高品質的mRNA反轉錄試劑或試劑盒對所提取的mRNA進行反轉錄，試劑或試劑盒需要包含gDNA擦除試劑。

請務必按照所選反轉錄試劑盒的操作說明。在使用反轉錄試劑之前，請用gDNA擦除試劑去除掉基因組的DNA序列。

使用Oligo 的（T）引物進行反轉錄，不要用Random Primer!

反轉錄得到的cDNA可以作為輕鏈和重鏈可變區的PCR擴增的模版，也可以保存于-20℃備用。

3）RCR擴增輕鏈kappa可變區（V_k）、重鏈可變區（V_H）

1^st PCR反應程序: 

94℃  5 min，（94℃ 30s,  46℃ 30s，72℃ 55s）X35循環，72℃延伸10min，4℃ ∞ 。

2^nd PCR反應程序: 

94℃  5 min，（94℃ 30s,  57℃ 30s，72℃ 55s）X35循環，72℃延伸10min，4℃ ∞ 。

4）PCR 產物鑒定及產物回收

PCR產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，如果輕鏈可變區（V_k）得到擴增產物∽450bp,重鏈可變區（V_H）得到擴增產物為∽600bp，分別切膠回收PCR產物。

5）PCR膠回收產物的T載體連接

選用通用型T載體（連接平端PCR產物和帶A尾巴PCR產物），按照操作說明進行連接；

6）連接產物轉化DH5a感受態細胞

（1）連接產物(10ul)加入冰上解凍的100ul感受態細胞DH5a或TOP10；

(2) 42℃熱擊60-90秒,冰上冷卻3-5min;

(3) 向離心管中加入1ml不含抗生素的LB培養基，輕輕混勻，置于37 ℃，220 rpm搖床振蕩培養1小時，使細菌復壯；

(4) 4000rpm離心 2-3分鐘，棄掉上清1ml，剩余100ul培養基重懸離心管底部菌體，將其涂布于含相應抗生素的篩選平板上；

(5) 將平板正面向上放在37℃培養箱1小時，待菌液完全被平板吸收后，倒扣平板放置37℃培養箱16-24小時。

7）連接產物初步鑒定

如果熟練掌握菌落PCR鑒定技術，可進行PCR菌落鑒定（載體上下游測序用引物對連接產物）。

常規方法：挑取平板上的菌落，加入到2ml含有抗生素的培養基中220rpm培養搖床37 ℃培養至其渾濁，其1ul菌液進行PCR鑒定即可。

注意：

Ø   建議每個V_H（重鏈可變區）平板挑取10個菌斑培養并做PCR鑒定，建議每個V_k（kappa輕鏈可變區）平板挑取10個以上菌斑培養并做PCR鑒定；PCR鑒定引物為T載體測序的上下游引物；

Ø   PCR引物為載體測序的上下游引物，加上Primer SP2/0引物（1ul/50ul PCR體系）；PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，V_H電泳正確的結果為750bp左右；V_K電泳正確的結果應該為580bp左右，且沒有250-300bp左右條帶（下圖紅框內為SP2/0自身的約為250-300bp的kappa干擾序列條帶）。

8）測序

PCR初步鑒定正確的菌液送去測序，測序引物為T載體對應的上下游引物（一般為M13F/M13R）。

9）測序結果分析及應用

返回的測序結果去掉T載體序列后，即為擴增得到的V_H和V_K序列，由于外源DNA片段插入T載體是沒有方向性的，因此我們得到的可能是反向互補序列，需要將其轉換過來。

通過NCBI數據庫比對找到所得序列的CDS編碼區，獲取正確的讀碼框，翻譯出對應的氨基酸序列；如果需要得到抗體全序列，可以與相應抗體亞型的保守區序列拼接，得到完整的抗體重鏈和輕鏈序列。