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產(chǎn)品簡介：

單克隆抗體序列可變區(qū)獲取和序列測定是基因工程抗體的關(guān)鍵步驟，但是由于抗體基因序列5’端復(fù)雜性和多樣性，往往獲取可變區(qū)序列比較困難，5’-RACE雖然可以實(shí)現(xiàn)，但是成本高，操作復(fù)雜，由于抗體序列的復(fù)雜性和SP2/0基因組干擾序列太多，RACE往往不是最優(yōu)的手段；本試劑盒通過優(yōu)化設(shè)計(jì),采用高效引物Mix組合覆蓋，經(jīng)過兩輪PCR擴(kuò)增，可以快速簡便擴(kuò)增出抗體基因可變區(qū)序列，擴(kuò)增獲得的序列連接至T載體，通過簡單測序，可以快速得到抗體可變區(qū)序列，后期用于基因工程抗體的改造表達(dá)。

之前版本試劑盒配置了RT反轉(zhuǎn)錄Mix，鑒于很多實(shí)驗(yàn)室對于mRNA提取和反轉(zhuǎn)錄技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)成熟，因此本簡版試劑盒只提供最核心的PCR擴(kuò)增試劑，這樣大大節(jié)約了實(shí)驗(yàn)者的科研成本。

本試劑盒的優(yōu)勢：

1.   操作時間短，如果操作順利，3-5工作日內(nèi)可以獲取到抗體可變區(qū)序列；

2.   本試劑盒操作簡單，具備基本分子生物學(xué)操作基礎(chǔ)的人可以輕松入手實(shí)現(xiàn)操作；

3.  本試劑盒可以剔除和降低基因組或者相似序列對序列準(zhǔn)確度的影響；

4.   實(shí)驗(yàn)室內(nèi)實(shí)現(xiàn)抗體基因測序，成本更低：目前委托技術(shù)服務(wù)公司進(jìn)行雜交瘤測序費(fèi)用較高；

5.   實(shí)驗(yàn)室內(nèi)實(shí)現(xiàn)抗體基因測序，更有利于抗體序列的核心知識產(chǎn)權(quán)和專利的保護(hù)。

特別注意事項(xiàng)：

1.   本試劑盒適用于單抗輕鏈為Kappa亞型細(xì)胞株，如果輕鏈Lambda請聯(lián)系購買另外產(chǎn)品。

2.   本試劑盒的操作人員必須熟練掌握分子生物學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作技能，包括mRNA提取，反轉(zhuǎn)錄，PCR擴(kuò)增， PCR產(chǎn)物膠回收，T載體連接，大腸桿菌轉(zhuǎn)化，菌落PCR鑒定 ，以及測序結(jié)果的分析解讀和序列比對等技能；

3.   實(shí)驗(yàn)室必須具備開展以上實(shí)驗(yàn)所必須的實(shí)驗(yàn)儀器和實(shí)驗(yàn)條件；

4.   實(shí)驗(yàn)室必須具備開展以上實(shí)驗(yàn)所必須的高性能試劑；

5.   務(wù)必保證雜交瘤細(xì)胞株為單克隆，狀態(tài)好，傳代培養(yǎng)越少越好；

6.   實(shí)驗(yàn)室環(huán)境必須潔凈，實(shí)驗(yàn)人員操作規(guī)范，避免交叉污染。

試劑盒組分

雜交瘤可變區(qū)基因片段擴(kuò)增基本流程：

流程包括以下環(huán)節(jié)：mRNA提取→反轉(zhuǎn)錄→1^st PCR和2^ndPCR擴(kuò)增→PCR產(chǎn)物膠回收→T載體連接→大腸桿菌轉(zhuǎn)化→菌落PCR鑒定→測序結(jié)果識讀→序列比對/抗體序列分析→抗體重組表達(dá)

1.實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

1）為確保實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蝽樌_展，請確保您已經(jīng)掌握試劑盒操作流程中各環(huán)節(jié)所需的技能:

2）必備儀器：PCR儀，水平電泳儀，高速離心機(jī)

3）其他需要您準(zhǔn)備的試劑：RNA提取試劑盒/Trizol試劑(氯仿，75% 乙醇，無RNase ddH₂O, 異丙醇)，高品質(zhì)mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑（盒），T-載體連接試劑盒，DNA凝膠回收試劑盒，ddH₂O(無RNase）等

4）必備耗材：吸頭/EP管(無RNase）

2.實(shí)驗(yàn)操作

1）雜交瘤細(xì)胞mRNA提取

（1）培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞

首先確保你的雜交瘤細(xì)胞株是單克隆，雜交瘤細(xì)胞株培養(yǎng)至細(xì)胞數(shù)約 1.0×10⁵-1.0×10⁶（例如，24孔板中1-2個長滿孔的細(xì)胞量）時，將細(xì)胞吹起重懸，1500rpm x 5min， 離心收集細(xì)胞；同時收集細(xì)胞培養(yǎng)上清用于鑒定單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的亞型。

（2）單抗亞型及輕鏈測定

步驟1收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清，通過ELISA方法測定抗體亞型（如果之前已經(jīng)完成亞型和輕鏈鑒定,此處不必再測），亞型測定不方便的,可以購買我們的亞型測定試劑盒。

（3）雜交瘤細(xì)胞mRNA的提取

以下步驟僅供參考，強(qiáng)烈建議:使用高品質(zhì)RNA提取試劑盒并消化掉基因組DNA

1步驟（1）得到細(xì)胞離心沉淀，盡量吸干殘余液體；在超凈工作臺環(huán)境，向細(xì)胞沉淀中加入1ml Trizol裂解液，充分裂解細(xì)胞，靜置5min；

2加入200uL氯仿，劇烈震蕩30秒，室溫靜置3min，12000 rpm  15 min；

3取上層水樣層至新的EP管，加入等體積異丙醇，室溫靜置30分鐘或-20℃ 放1-2小時；

412000 rpm  10 min，棄上清，管底白色沉淀物即為RNA;

5加入1 mL 75% 乙醇重懸洗滌RNA，12000rpm  10 min，小心吸棄液體，在超凈臺內(nèi)風(fēng)干管底沉淀；

6加入50ul 無RNase ddH₂O復(fù)溶（如果難以溶解，請置于55℃至完全溶解），即得到mRNA,立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄步驟，或者-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2）RT反轉(zhuǎn)錄

上述步驟得到的mRNA立即進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄。

選用高品質(zhì)的mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑或試劑盒對所提取的mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，試劑或試劑盒需要包含gDNA擦除試劑。

請務(wù)必按照所選反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說明。在使用反轉(zhuǎn)錄試劑之前，請用gDNA擦除試劑去除掉基因組的DNA序列。

使用Oligo 的（T）引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，不要用Random Primer!

反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA可以作為輕鏈和重鏈可變區(qū)的PCR擴(kuò)增的模版，也可以保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

3）RCR擴(kuò)增輕鏈kappa可變區(qū)（V_k）、重鏈可變區(qū)（V_H）

1^st PCR反應(yīng)程序: 

94℃  5 min，（94℃ 30s,  46℃ 30s，72℃ 55s）X35循環(huán)，72℃延伸10min，4℃ ∞ 。

2^nd PCR反應(yīng)程序: 

94℃  5 min，（94℃ 30s,  57℃ 30s，72℃ 55s）X35循環(huán)，72℃延伸10min，4℃ ∞ 。

4）PCR 產(chǎn)物鑒定及產(chǎn)物回收

PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，如果輕鏈可變區(qū)（V_k）得到擴(kuò)增產(chǎn)物∽450bp,重鏈可變區(qū)（V_H）得到擴(kuò)增產(chǎn)物為∽600bp，分別切膠回收PCR產(chǎn)物。

5）PCR膠回收產(chǎn)物的T載體連接

選用通用型T載體（連接平端PCR產(chǎn)物和帶A尾巴PCR產(chǎn)物），按照操作說明進(jìn)行連接；

6）連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞

（1）連接產(chǎn)物(10ul)加入冰上解凍的100ul感受態(tài)細(xì)胞DH5a或TOP10；

(2) 42℃熱擊60-90秒,冰上冷卻3-5min;

(3) 向離心管中加入1ml不含抗生素的LB培養(yǎng)基，輕輕混勻，置于37 ℃，220 rpm搖床振蕩培養(yǎng)1小時，使細(xì)菌復(fù)壯；

(4) 4000rpm離心 2-3分鐘，棄掉上清1ml，剩余100ul培養(yǎng)基重懸離心管底部菌體，將其涂布于含相應(yīng)抗生素的篩選平板上；

(5) 將平板正面向上放在37℃培養(yǎng)箱1小時，待菌液完全被平板吸收后，倒扣平板放置37℃培養(yǎng)箱16-24小時。

7）連接產(chǎn)物初步鑒定

如果熟練掌握菌落PCR鑒定技術(shù)，可進(jìn)行PCR菌落鑒定（載體上下游測序用引物對連接產(chǎn)物）。

常規(guī)方法：挑取平板上的菌落，加入到2ml含有抗生素的培養(yǎng)基中220rpm培養(yǎng)搖床37 ℃培養(yǎng)至其渾濁，其1ul菌液進(jìn)行PCR鑒定即可。

注意：

Ø   建議每個V_H（重鏈可變區(qū)）平板挑取10個菌斑培養(yǎng)并做PCR鑒定，建議每個V_k（kappa輕鏈可變區(qū)）平板挑取10個以上菌斑培養(yǎng)并做PCR鑒定；PCR鑒定引物為T載體測序的上下游引物；

Ø   PCR引物為載體測序的上下游引物，加上Primer SP2/0引物（1ul/50ul PCR體系）；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，V_H電泳正確的結(jié)果為750bp左右；V_K電泳正確的結(jié)果應(yīng)該為580bp左右，且沒有250-300bp左右條帶（下圖紅框內(nèi)為SP2/0自身的約為250-300bp的kappa干擾序列條帶）。

8）測序

PCR初步鑒定正確的菌液送去測序，測序引物為T載體對應(yīng)的上下游引物（一般為M13F/M13R）。

9）測序結(jié)果分析及應(yīng)用

返回的測序結(jié)果去掉T載體序列后，即為擴(kuò)增得到的V_H和V_K序列，由于外源DNA片段插入T載體是沒有方向性的，因此我們得到的可能是反向互補(bǔ)序列，需要將其轉(zhuǎn)換過來。

通過NCBI數(shù)據(jù)庫比對找到所得序列的CDS編碼區(qū)，獲取正確的讀碼框，翻譯出對應(yīng)的氨基酸序列；如果需要得到抗體全序列，可以與相應(yīng)抗體亞型的保守區(qū)序列拼接，得到完整的抗體重鏈和輕鏈序列。