【實驗原理】

目前的研究表明皮膚衰老原因有：活性氧積聚、膠原蛋白與彈性蛋白流失、β-半乳糖苷酶活性增高、基質金屬酶上調、MAPK和cAMP途徑激活等等。

皮膚皺紋的出現與膠原蛋白的正常合成和表達密切相關。斑馬魚具有與人高度保守的調控膠原蛋白的相關基因。通過檢測斑馬魚膠原蛋白基因RNA的相對表達量可以反映護膚產品的抗皺功效。彈性蛋白與膠原蛋白共同存在與胞外基質對于皮膚彈性的維系起著重要作用，是皮膚松弛、下垂等老化現象的主要原因。斑馬魚具有與人高度保守的調控彈性蛋白的基因，通過檢測斑馬魚彈性蛋白基因RNA的相對表達量可以反映護膚產品的緊致功效。

活性氧（ROS）是含氧的化學反應性化學物質，其在細胞信號傳導和體內平衡中具有重要作用。然而在紫外線暴露期間，ROS水平會急劇增加。這可能會對細胞結構造成嚴重損害，這被稱為氧化應激。當自由基產生量大于機體清除能力時就發生氧化應激反應。氧化應激時超氧化物歧化酶( Superoxide dismutase，SOD) 活性降低，產生過多的脂質過氧化產物丙二醛( Malondialdehyde，MDA) ，谷胱甘肽過氧化物酶( Glutathione peroxidase，GSH-Px) 是體內重要過氧化物分解酶，能使過氧化物MDA 還原，保護細胞免受氧化損傷。因此SOD、MDA、GSH-PX 作為判斷氧化應激程度的重要指標。

衰老與端粒酶活性相關。端粒有重要的生物學功能，隨著年齡的增長，端粒DNA 在體細胞分裂過程中自然縮短，當端粒長度變得非常短時，端粒功能受損，導致基因組不穩定、細胞衰老和凋亡。體細胞端粒會隨著年齡的增長而逐漸縮短，此時端粒酶會起到延緩端?？s短的作用。

衰老與代謝緩慢相關，皮膚微循環可以反映代謝的快慢?？梢岳醚鞣治鰞x檢測受試斑馬魚的血流速度，評價改善微循環功效。

【實驗方法】

將受測試斑馬魚分成若干組，含正常對照組和化妝品組。其中正常對照組未經任何處理，化妝品組添加受試化妝品。加入化妝品24 h后，對每組斑馬魚進行收樣，使用試劑盒提取RNA，使用q-PCR檢測目的基因的轉錄水平，通過斑馬魚皮膚膠原蛋白基因和彈性蛋白基因相對表達量評價化妝品增加皮膚彈性作用。(指標1、2)

將受測試斑馬魚分成若干組，含正常對照組、模型對照組和化妝品組。其中正常對照組未經任何處理，模型對照組和化妝品組都加入等量的甲萘醌?；瘖y品組在加入甲萘醌的同時加入一定濃度的化妝品。使用化妝品24 h后，對斑馬魚整體進行特異性熒光染色，觀察斑馬魚卵黃囊活性氧自由基產生情況。（指標3）

將受測試斑馬魚分成若干組，含正常對照組、模型對照組和化妝品組。其中正常對照組未經任何處理，模型對照組和化妝品組都加入等量的過氧化氫?；瘖y品組在加入甲萘醌的同時加入一定濃度的化妝品。處理6 天后，將斑馬魚用4%多聚甲醛固定過夜，用β-半乳糖苷酶染色試劑盒進行染色。染色結束后，分析統計斑馬魚整體β-半乳糖苷酶染色強度，以β-半乳糖苷酶染色強度的統計學分析結果評價供試品對衰老斑馬魚β-半乳糖苷酶活性的抑制作用；將斑馬魚勻漿取上清，用端粒酶ELISA試劑盒進行反應，應用多功能酶標儀測定各實驗組端粒酶含量，以統計學分析結果評價供試品對衰老斑馬魚端粒酶含量的增加作用；將斑馬魚勻漿取上清，用SOD? ELISA試劑盒進行反應，應用多功能酶標儀分別測定各實驗組SOD含量，以SOD含量的統計學分析結果評價樣品對衰老斑馬魚SOD含量增加作用；將斑馬魚勻漿取上清，用GSH ELISA試劑盒進行反應，應用多功能酶標儀分別測定各實驗組GSH含量，以GSH含量的統計學分析結果評價煙酰胺單核苷酸對衰老斑馬魚GSH含量增加作用。（指標4、5、6、7）

將斑馬魚分成兩組，分別是正常對照組和供試品組。正常對照組不做處理，供試品組添加一定濃度的受試化妝品，孵育24h小時后，通過血流分析儀分析觀察各組斑馬魚的血流速度，以血流速度的增加量評價受試化妝品改善微循環功效。（指標8）

【評價指標】

1、Ⅰ型膠原蛋白基因相對表達量

2、彈性蛋白基因相對表達量

3、ROS清除作用

4、β-半乳糖苷酶活性抑制作用

5、端粒酶含量增加

6、SOD活性

7、GSH活性

8、改善微循環-血流速度

【結果展示】（展示圖片僅供參考，實際實驗組別依據合同而定）

1、膠原or基因相對表達量：提供柱狀圖

圖1. 斑馬魚體內col1a1a基因相對表達量

3、ROS熒光強度

4、β-半乳糖苷酶活性、端粒酶活性增加、SOD活性、GSH活性 (柱形圖 略)

5、改善微循環-血流速度（柱狀圖+視頻）

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