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?——即蛋白質藥物的N糖基化位點分析技術服務
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作為一種普遍存在的翻譯后修飾，N糖基化對蛋白質的結構和功能有著重要影響，了解N糖基化修飾位點是理解蛋白質復雜多樣生物功能的一個重要前提。ATP結合了蛋白質分子在溶液內的還原酶解、N糖基化肽段富集、H218O中脫糖以及高靈敏度的LC-MS檢測，可對供試品的N糖基化修飾位點進行分析，明確供試品的N糖基化修飾位點，并提供相關的實驗證據，包括多肽分子XICs質譜圖、MS2譜圖和數據分析結果等。
“抗體類藥物的糖基化修飾情況是最重要的質量控制參數之一”
技術指標
本方法所檢測的樣品是蛋白質或多肽類供試品，測量的是N糖基化修飾的天冬酰胺所在多肽分子的分子量，測定的是該多肽分子的氨基酸序列。蛋白質或者多肽供試品既可以是固體樣品，也可以是溶液樣品。供試品的量應該不少于200μg，供試品如果為固體，應為蛋白質多肽凍干制品；如果供試品為液體，樣品中蛋白質多肽濃度應盡可能在2mg/ml以上。
本方法檢測是N糖基化修飾天冬酰胺位點和其所在多肽分子的氨基酸序列，被修飾的天冬酰胺所在序列需符合NXS/T結構（X為非脯氨酸）。質譜數據經軟件MASCOT分析，鑒定肽段的significant P需小于0.05，且Mascot Score值需大于20。
N糖基化位點測定方法所使用的儀器：Thermo公司生產的高校液相串聯質譜儀Q Exactive和Easy nLC1000。
案例分析
下圖顯示一個糖基化分析中糖基化肽段圖譜（XIC of LC-MS/MS）。
圖為糖基化分析中糖基化肽段圖譜（XIC of LC-MS/MS）
下圖為蛋白質類供試品下N糖基化位點分析的MS/MS圖譜。
圖為蛋白質類供試品糖基化位點分析的MS/MS圖譜
Q&A
1)?????N糖基化位點分析實驗參數的簡介。
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|
Item |
Value |
|
Type of Search |
MS/MS Ion Search |
|
Enzyme |
Trypsin |
|
Mass Values |
Monoisotopic |
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Max Missed Cleavages |
2 |
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Variable Modifications |
Carbamidomethyl (C), Oxidation (M), Deamidation 180(N) |
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Peptide Tolerance |
20 ppm |
|
MS2?Tolerance |
0.1 Da |
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Fragmentation |
HCD |
2)?????N-linked糖基化位點的定性分析簡介。
本方法通過高度富集供試品中糖基化修飾肽段、高精度LC-MS/MS質譜檢測以及嚴謹的質譜數據軟件分析，其檢測靈敏度較高，特異性較強，數據分析結果準確。廣泛適用于蛋白質供試品N糖基化修飾位點確證。
3)?????質譜方法對N糖基化位點確認分析中的原理介紹。
一般發生N-糖基化位點修飾的蛋白，都有基本的氨基酸結構骨架為：NXS或NXT的結構。為了鑒定N-糖基化修飾位點，首先用蛋白酶酶解蛋白質，再富集N-糖基化修飾肽段，最后用PNGase F糖苷酶在18O水中切除鏈接在ASN上的糖鏈。這樣會使ASN分子量增加2.9890 Da。通過高精度LC-MS質譜檢測脫糖后肽段，經MASCOT軟件檢索數據庫（MASCOT是一種蛋白質鑒定軟件，曾被Frost & Sullivan研究機構評為生物質譜軟件的黃金標準），確認脫糖后分子量與其理論分子量的變化以及糖基化修飾肽段的序列，從而確定該蛋白質的糖基化位點。