MTT/CCK8/XTT等細胞增殖檢測

實驗介紹

(a)?MTT

MTT為黃色化合物，是一種接受氫離子的染料?；罴毎阽晁崦摎涿负图毎豤的作用下四唑環開裂，生成藍色的甲月替結晶并沉積在細胞中，甲月替結晶的生成量僅僅與活細胞數目成正比（死細胞中的琥珀酸脫氫酶消失，不能還原MTT）。還原生成的甲月替結晶可在含50%的N,N-二甲基甲酰胺、20%的十二甲基磺酸鈉（PH?4.7）或10%酸化十二甲基磺酸鈉（PH?4.7）的溶液中溶解。利用酶標儀測定490nm波長處的光密度測出OD值，即反映活細胞數目。也可利用DMSO（二甲基亞砜）來溶解。用DMSO之前要盡量去掉培養液，一遍DMSO溶解甲月替顆粒，進行比色測定。

1．取96孔細胞培養板，每孔中加0.1ml含2×104～10×104靶細胞的培養液（含10％小牛血清的RPMI-1640培養液），在37℃?5％?CO2的飽和水汽二氧化碳培養箱中培養2～3小時讓細胞帖壁（如果是懸浮細胞可直接進行下一步）

2．用RPMI-1640培養液2～10倍遞次稀釋細胞因子標準品，根據情況2～5倍遞次稀釋待檢樣品，每孔加0.1ml稀釋的標準品和待檢樣品，每個稀釋度3個重復孔。對照孔6個：3個陽性對照孔，每孔加0.1ml含大劑量細胞因子的RPMI-1640培養液，3個陰性對照孔，每孔加0.1ml?RPMI-1640培養液。在37℃?5％?CO2的飽和水汽二氧化碳培養箱中培養24～48小時或預定的時間。

3．吸去培養液，用PBS洗滌一次（如為懸浮細胞，應在吸去上清液前離心培養板）。

4．每孔加0.1ml?PBS和10μl?MTT染液，在37℃?5％?CO2的飽和水汽二氧化碳培養箱中培養4～6小時。

5．每孔加0.1ml酸化異丙醇，也可用含10％?SDS的10mmol/L?HCl代替酸化異丙醇，在振蕩器上振蕩混勻，讓還原產物充分溶解。置酶聯檢測儀上測定光密度（OD）值，檢測波長570nm，參考波長630nm。以OD值對樣品稀釋度作圖，比較標準曲線和待測樣品曲線即可求得待測樣品中細胞因子的含量。

(b)?CCK-8檢測細胞增殖（活力）：

CCK-8（cell-counting?kit-8）檢測試劑盒是應用WST-8取代MTT被還原，WST-8是一種類似于MTT的化合物，在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內的一些脫氫酶還原生成橙黃色的formazan。WST-8產生的formazan比XTT和MTS產生的formazan更易溶解。且WST-8相較XTT和MTS化學性狀更穩定，?因此實驗結果相對更加穩定。此外，WST-8相較MTT、XTT，線性范圍相對寬，靈敏度更高。?

當細胞增殖得越多越快，則formazan產生量越多，顏色越深；反之，當內外因造成的細胞毒性越大，則顏色越淺。對于同樣的細胞，顏色的深淺和細胞數目呈線性關系。應用酶標儀測定吸光值并進行統計學計算便可以獲得細胞增殖（活性）相關數據。

(c)?XTT：

化學名：2,3-?bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]?-2H-tetrazolium?hydroxide，作為線粒體脫氫酶的作用底物，被活細胞還原成水溶性的橙黃色甲臢產物。當XTT與電子偶合劑（例如PMS）聯合應用時，其所產生的水溶性的甲臢產物的吸光度與活細胞的數量成正比。

用XTT代替MTT可省去溶解還原產物結晶的步驟，XTT可以被活細胞中的代謝酶還原成黃色水溶性的代謝產物（formazan）。代謝產物在OD450處有吸收峰。

優點：1、使用方便，省去了洗滌細胞；2、檢測快速；3、靈敏度高，甚至可以測定較低細胞密度；4、重復性優于MTT。

缺點：XTT水溶液不穩定，需要低溫保存或現配現用。

應用范圍：

生物活性因子的活性檢測；

大規模的抗腫瘤藥物篩選；

細胞增殖實驗；

藥物或基因導致的細胞毒性試驗；

藥敏試驗等。

服務周期：3周。

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