轉錄組測序及分析

轉錄組即某個物種或特定細胞在某一功能狀態下產生的所有RNA的總和，是研究細胞表型和功能的一個重要手段。與基因組不同的是，轉錄組的定義中包含了時間和空間的限定。同一細胞在不同的生長時期及生長環境下，其基因表達情況是不完全相同的。轉錄組測序（RNA-Seq）是指利用第二代高通量測序技術進行 cDNA測序，全面快速地獲取某一物種特定器官或組織在某一狀態下的幾乎所有轉錄本。相對于傳統芯片而言，RNA-Seq無需預先設計探針，即可對任意物種的任意細胞類型的轉錄組進行檢測，能夠提供更精確的數字化信號，更高的檢測通量以及更廣泛的檢測范圍，是目前深入研究轉錄組復雜性的強大工具。

一、技術路線

Illumina Hiseq高通量測序平臺可對轉錄組進行測序，Illumina Hiseq測序技術的優點是單次測序獲得的數據量大，能夠得到更高的覆蓋率，檢測到更多低豐度的轉錄本，在已知基因組序列物種的轉錄組分析中更具優勢。

二、數據分析

1．無參考基因組序列的轉錄組（De novoTranscriptome Analysis）

標準信息分析

1)??? 對原始數據進行去除接頭、污染序列及低質量reads的處理；

2)??? 數據產出統計及測序數據的成分和質量評估；

3)??? 組裝結果分析；

4)??? Unigene功能注釋；

5)??? Unigene的GO分類；

6)??? Unigene的COG 分類；

7)??? Unigene代謝通路分析；

8)??? 預測編碼蛋白框（CDS）；

9)??? Unigene表達差異分析；

10)?? Unigene在樣品間的差異GO分類和Pathway富集性分析。

定制化信息分析

可結合客戶的需求，協商確定定制化信息分析內容；

2．有參考基因組序列的轉錄組（Transcriptome analysis with reference genome）

標準信息分析

1)?? 對原始數據進行去除接頭、污染序列及低質量reads的處理；

2)?? 測序評估；

3)?? 基因表達注釋；

4)?? 基因差異表達分析；

5)?? 對基因結構進行優化（僅針對真核生物）；

6)?? 鑒定基因的可變剪接（僅針對真核生物）；

7)?? 預測新轉錄本；

8)?? SNP 分析。

定制化信息分析

可結合客戶的需求，協商確定定制化信息分析內容。

3．鏈特異性轉錄組（需提供參考基因序列、參考基因組序列）

鏈特異性技術，也稱 strand-specific RNA sequencing method，是一種能夠區分正義鏈或反義鏈信息的方法，其對于轉錄組的功能分析具有十分重要的意義。

標準信息分析

1）? 正負鏈信息；

2）? 反義鏈表達；

3）? 其他（分析內容同常規轉錄組）。

定制化信息分析

可結合客戶的需求，協商確定定制化信息分析內容。

4．均一化文庫

分析內容同常規轉錄組。

5．非編碼RNA測序分析（需提供參考基因序列、參考基因組序列及基因注釋結果）

定制化信息分析

可結合客戶的需求，協商確定定制化信息分析內容。

三、常見問題解答

1. 進行轉錄組測序對于樣品有什么要求？

答：1）請提供總量大于2g的新鮮樣品；植物材料應盡量選取幼嫩部位，避免過老的組織。

2）采樣后將樣品立即用液氮速凍，保存于-80℃（保存期不超過一個月），送樣時使用干冰運輸（不超過72h）。

3）送樣管務必標清樣品編號，管口使用Parafilm膜密封.

4）樣品保存期間切忌反復凍融。

5）樣品質量合格與否的判斷標準：Agilent 2100 Bioanalyzer RNA芯片RIN值8.0以上 。

6）請填寫完整的送樣訂單，并提供盡量詳細的物種基因組背景資料信息，如基因組大小，基因平均長度，預計表達的數量等。

2．轉錄組測序時，無參考基因組序列的情況下，有哪些信息分析能進行？

答：1）數據產出統計及測序數據的成分和質量評估

2）組裝結果分析（Contig長度分布、Scaffold長度分布、Unigene長度分布）

3）Unigene功能注釋

4）Unigene的GO分類

5）Unigene代謝通路分析

6） 預測編碼蛋白框（CDS）

7） Unigene表達差異分析（兩個或兩個以上樣品超過十次比對按個性化信息分析收費）

8） Unigene在樣品間的差異GO分類（兩個或兩個以上樣品） 和Pathway富集性分析
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3．轉錄組測序時，有參考基因組序列的情況下，有哪些信息分析能進行？

答：1）測序評估（比對統計、測序隨機性評估、Reads在基因組上的分布）

2）基因表達注釋（基因覆蓋度、覆蓋深度分布等）

3）基因差異表達分析（兩個或兩個以上樣品，超過十次比對按個性化信息分析收費）

4）對基因結構進行優化（僅針對真核生物）

5）鑒定基因的可變剪接（僅針對真核生物）

6）預測新轉錄本

7）SNP分析

四、相關案例

1. 吸煙與肺癌對呼吸道RNA-Seq影響

圖A 為NuGEN (NG)技術與Illumina (IL)技術比較

圖B為NuGEN (NG)的reads數與Illumina (IL)的reads相關性

圖C在A中發現的呼吸道轉錄組基因分布

2. 以轉錄組分析為基礎的對宿主感染霍亂弧菌的機制的研究

圖A和圖B描述了被感染霍亂弧菌的細胞的基因表達(A, rabbit [Illumina]; B, mouse [Helicos])左邊為染色體I，右邊為染色體II

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上圖為霍亂弧菌在細胞中和感染期間不同基因表達

五、相關文獻

1. Defining the maize transcriptome? de novo using deep RNA–Seq Jeffrey Martin, Stephen Gross, Cindy Choi, Tao Zhang, Erika Lindquist, Chia- Lin Wei, ZhongWang

2. RNA-Seq-Based Monitoring of Infection-Linked Changes in Vibrio cholerae Gene Expression

Anjali Mandlik, Jonathan Livny, William P. Robins, Jennifer M. Ritchie, John J. Mekalanos, and Matthew K. Waldor

3. Characterizing the Impact of Smoking and Lung Cancer on the Airway Transcriptome Using RNA-Seq Jennifer Beane, Jessica Vick, Frank Schembri, et al. 2011;4:803-817. Published online June 1, 2011. Cancer Prev Res