乙肝造模服務(wù)
產(chǎn)品名稱： 乙肝造模服務(wù)
英文名稱： 乙肝造模服務(wù)
產(chǎn)品編號(hào)：
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武漢樞密腦科學(xué)技術(shù)有限公司
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乙肝造模
一、背景
? ? ?乙肝病毒 (Hepatitis B virus , HBV) 屬于嗜肝DNA病毒科(Hepadanaviridae)，具有很強(qiáng)感染性，通過在宿主細(xì)胞核內(nèi)形成共價(jià)閉環(huán)的DNA (covalently closed circular DNA, cccDNA) 而穩(wěn)定存在。慢性乙肝病毒感染可導(dǎo)致嚴(yán)重肝臟病變或衰竭，甚至造成癌癥。雖然通過接種乙肝疫苗可以有效預(yù)防HBV的感染，但現(xiàn)有療法不能完全清除病毒，全世界仍有約2.57億（3.5%）人口感染HBV，其中非洲、中東、中國和東南亞以及西太平洋地區(qū)感染率較高，共計(jì)約2.35億人口，存在巨大的新疫苗及新藥研發(fā)的需求缺口1,2。
? ? ?現(xiàn)有乙肝治療藥物主要為逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和干擾素，患者需長期用藥，一旦停止用藥病毒就會(huì)重新爆發(fā)。2018年11月，F(xiàn)DA發(fā)布的抗乙肝病毒感染藥物開發(fā)指南提出，開發(fā)新型乙肝療法的目標(biāo)是“在治療結(jié)束后較低的病毒復(fù)發(fā)和肝臟疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)”3，這意味著臨床前藥物評(píng)估需要在能模擬乙肝病毒長期感染的動(dòng)物模型中進(jìn)行。然而乙肝病毒宿主范圍狹窄，目前用于研究的乙肝動(dòng)物模型有人HBV樹鼩模型及人HBV黑猩猩模型。但是人HBV自然感染樹鼩存在如感染指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性和穩(wěn)定性差、感染持續(xù)時(shí)間短、感染率低等方面的問題，而黑猩猩屬于瀕危動(dòng)物，因此，利用HBV直接感染的動(dòng)物模型局限性很大。于是，研究者們把目光轉(zhuǎn)向了遺傳背景單一的模式動(dòng)物小鼠，由于小鼠缺乏HBV受體，不能用直接感染的方法建模，而rAAV(recombinant adeno-associated virus,rAAV)載體安全性高、宿主細(xì)胞范圍廣，利用rAAV載體攜帶HBV全長基因組經(jīng)尾靜脈注射導(dǎo)入小鼠，可實(shí)現(xiàn)動(dòng)物肝臟的持續(xù)感染。該造模方法具備諸如適用范圍廣、均一穩(wěn)定、成功率高、量效關(guān)系明顯、制備簡單等優(yōu)點(diǎn)。
二、產(chǎn)品描述
? ? ? 乙肝病毒基因組為松散的環(huán)狀雙鏈DNA(relaxd circular DNA, RC DNA)，在宿主細(xì)胞核內(nèi)形成cccDNA作為轉(zhuǎn)錄模板，形成乙肝病毒擴(kuò)增所必需的前基因組RNA (pregenomic RNA, pgRNA)，再依次經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成負(fù)鏈DNA、DNA復(fù)制形成雙鏈DNA，完成病毒基因組的擴(kuò)增過程。2009年，韓國延世大學(xué)Wang-Shick Ryu教授課題組首次報(bào)道了通過AAV攜帶乙肝病毒基因組的方式模擬乙肝病毒感染的過程4,5。樞密科技利用AAV基因組能在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定存在的特性以及8型AAV強(qiáng)嗜肝性的特點(diǎn)，開發(fā)了攜帶1.3拷貝HBV全長基因組的腺相關(guān)病毒產(chǎn)品rAAV-HBV1.3-mer WT replicon。此產(chǎn)品攜帶了血清型為ayw、基因型為D型的乙肝病毒基因組，其模擬了pgRNA的形成，更貼近病毒天然的生活周期，能穩(wěn)定的建立乙肝病毒長期感染的狀態(tài)，加速抗乙肝藥物研發(fā)的進(jìn)程。
1. 分子構(gòu)建
2. 效果驗(yàn)證
? ? ?通過小鼠眼眶采血檢測(cè)血清中乙肝病毒標(biāo)記物HBsAg、HBeAg和DNA含量。結(jié)果顯示rAAV-HBV1.3-mer WT replicon注射后3-4d即可檢測(cè)到乙肝病毒的表達(dá)，且表達(dá)時(shí)間持續(xù)7周，實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定，個(gè)體差異性小。
三、質(zhì)控
? ? ?樞密的生產(chǎn)系統(tǒng)、質(zhì)控系統(tǒng)都嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)文件執(zhí)行，可確保產(chǎn)品質(zhì)量和批次間的穩(wěn)定性。該系統(tǒng)不含人源細(xì)胞系，避免了生產(chǎn)過程中產(chǎn)生野生型HBV病毒顆粒的風(fēng)險(xiǎn)，安全性更高。此系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的生產(chǎn)，而且具有較高的產(chǎn)率和穩(wěn)定性。
? ? ?腺相關(guān)病毒產(chǎn)品采用碘克沙醇密度梯度離心純化，通過熒光定量PCR檢測(cè)AAV基因組ITR序列測(cè)定滴度（見圖3），并通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）銀染檢測(cè)產(chǎn)品純度，如圖4所示，rAAV-HBV1.3-mer WT replicon三條特征條帶清晰，純度≥97%。
四、產(chǎn)品信息
2、操作人員需要經(jīng)過專業(yè)的生物安全培訓(xùn)并獲得生物安全培訓(xùn)合格證，嚴(yán)格按照生物安全實(shí)驗(yàn)規(guī)程和手冊(cè)進(jìn)行操作。建議操作人員接種乙型肝炎疫苗以獲得乙肝免疫能力。
3、感染了rAAV-HBV1.3-mer WT replicon的小鼠排泄物等可能含有HBV病毒，該HBV病毒對(duì)包括人在內(nèi)的靈長類動(dòng)物有潛在感染性和致病性，對(duì)樹鼩、鴨子等動(dòng)物的均具有感染性，故實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及廢棄物的處理需要嚴(yán)格遵循生物安全實(shí)驗(yàn)規(guī)程。
4、該病毒產(chǎn)品及其動(dòng)物模型的使用單位應(yīng)該有生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室資質(zhì)。
六、運(yùn)輸及保存方法
1、病毒采用干冰運(yùn)輸，通常1-2天送達(dá)。
2、病毒可在4℃短期保存1-2周，但滴度會(huì)有4-5倍的降低。長期保存需存放于-80℃。每凍融一次，病毒滴度降低10%左右，應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3、理論上，病毒可于-80℃保存6個(gè)月以上，但病毒儲(chǔ)存時(shí)間超過6個(gè)月后，建議在使用前重新測(cè)定滴度。
4、分裝保存，避免反復(fù)凍融。
5、避免細(xì)菌、蛋白酶等污染。
七、參考文獻(xiàn)
[1] Ganem D. Hepadnaviridae. The viruses and their replication [M] . // Fields B N,Knipe D M, Howley P M. Fields virology. 3rded. Philadelphia: Lippincott-Raven Publisher, 1996: 2703-2737.
[2] GLOBAL HEPATITIS REPO RT. 2017.
[3] Chronic Hepatitis B Virus Infection: Developing Drugs for Treatment Guidance for Industry. FDA. 2018.
[4] Haifeng Wang, Seahee Kim, and Wang-Shick Ryu. DDX3 DEAD-Box RNA Helicase Inhibits Hepatitis B Virus Reverse Transcription by Incorporation into Nucleocapsids. Journal of General Virology (2009). 5815-5824.
[5] Man-Young Cha, Dong-Kyun Ryu. Stimulation of hepatitis B virus genome replication by HBx is linked to both nuclear and cytoplasmic HBx expression. Journal of General Virology (2009). 90: 978-986.
? ? ?乙肝病毒 (Hepatitis B virus , HBV) 屬于嗜肝DNA病毒科(Hepadanaviridae)，具有很強(qiáng)感染性，通過在宿主細(xì)胞核內(nèi)形成共價(jià)閉環(huán)的DNA (covalently closed circular DNA, cccDNA) 而穩(wěn)定存在。慢性乙肝病毒感染可導(dǎo)致嚴(yán)重肝臟病變或衰竭，甚至造成癌癥。雖然通過接種乙肝疫苗可以有效預(yù)防HBV的感染，但現(xiàn)有療法不能完全清除病毒，全世界仍有約2.57億（3.5%）人口感染HBV，其中非洲、中東、中國和東南亞以及西太平洋地區(qū)感染率較高，共計(jì)約2.35億人口，存在巨大的新疫苗及新藥研發(fā)的需求缺口1,2。
? ? ?現(xiàn)有乙肝治療藥物主要為逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和干擾素，患者需長期用藥，一旦停止用藥病毒就會(huì)重新爆發(fā)。2018年11月，F(xiàn)DA發(fā)布的抗乙肝病毒感染藥物開發(fā)指南提出，開發(fā)新型乙肝療法的目標(biāo)是“在治療結(jié)束后較低的病毒復(fù)發(fā)和肝臟疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)”3，這意味著臨床前藥物評(píng)估需要在能模擬乙肝病毒長期感染的動(dòng)物模型中進(jìn)行。然而乙肝病毒宿主范圍狹窄，目前用于研究的乙肝動(dòng)物模型有人HBV樹鼩模型及人HBV黑猩猩模型。但是人HBV自然感染樹鼩存在如感染指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性和穩(wěn)定性差、感染持續(xù)時(shí)間短、感染率低等方面的問題，而黑猩猩屬于瀕危動(dòng)物，因此，利用HBV直接感染的動(dòng)物模型局限性很大。于是，研究者們把目光轉(zhuǎn)向了遺傳背景單一的模式動(dòng)物小鼠，由于小鼠缺乏HBV受體，不能用直接感染的方法建模，而rAAV(recombinant adeno-associated virus,rAAV)載體安全性高、宿主細(xì)胞范圍廣，利用rAAV載體攜帶HBV全長基因組經(jīng)尾靜脈注射導(dǎo)入小鼠，可實(shí)現(xiàn)動(dòng)物肝臟的持續(xù)感染。該造模方法具備諸如適用范圍廣、均一穩(wěn)定、成功率高、量效關(guān)系明顯、制備簡單等優(yōu)點(diǎn)。
二、產(chǎn)品描述
? ? ? 乙肝病毒基因組為松散的環(huán)狀雙鏈DNA(relaxd circular DNA, RC DNA)，在宿主細(xì)胞核內(nèi)形成cccDNA作為轉(zhuǎn)錄模板，形成乙肝病毒擴(kuò)增所必需的前基因組RNA (pregenomic RNA, pgRNA)，再依次經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成負(fù)鏈DNA、DNA復(fù)制形成雙鏈DNA，完成病毒基因組的擴(kuò)增過程。2009年，韓國延世大學(xué)Wang-Shick Ryu教授課題組首次報(bào)道了通過AAV攜帶乙肝病毒基因組的方式模擬乙肝病毒感染的過程4,5。樞密科技利用AAV基因組能在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定存在的特性以及8型AAV強(qiáng)嗜肝性的特點(diǎn)，開發(fā)了攜帶1.3拷貝HBV全長基因組的腺相關(guān)病毒產(chǎn)品rAAV-HBV1.3-mer WT replicon。此產(chǎn)品攜帶了血清型為ayw、基因型為D型的乙肝病毒基因組，其模擬了pgRNA的形成，更貼近病毒天然的生活周期，能穩(wěn)定的建立乙肝病毒長期感染的狀態(tài)，加速抗乙肝藥物研發(fā)的進(jìn)程。
1. 分子構(gòu)建
圖1 用于建立乙肝病毒感染動(dòng)物模型的rAAV-HBV1.3-mer WT replicon產(chǎn)品基因組結(jié)構(gòu)示意圖，包含完整乙肝病毒基因組的4個(gè)開放讀碼框和上游重復(fù)區(qū)域。
2. 效果驗(yàn)證
? ? ?通過小鼠眼眶采血檢測(cè)血清中乙肝病毒標(biāo)記物HBsAg、HBeAg和DNA含量。結(jié)果顯示rAAV-HBV1.3-mer WT replicon注射后3-4d即可檢測(cè)到乙肝病毒的表達(dá)，且表達(dá)時(shí)間持續(xù)7周，實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定，個(gè)體差異性小。
圖2 用rAAV-HBV1.3-mer WT replicon建立小鼠乙肝病毒長期感染模型效果測(cè)試。A-C，不同劑量病毒尾靜脈注射，檢測(cè)血清乙肝病毒標(biāo)記物含量，每個(gè)劑量組檢測(cè)5只小鼠。D-F，最高劑量組5只小鼠乙肝病毒標(biāo)記物個(gè)體檢測(cè)結(jié)果。
三、質(zhì)控
? ? ?樞密的生產(chǎn)系統(tǒng)、質(zhì)控系統(tǒng)都嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)文件執(zhí)行，可確保產(chǎn)品質(zhì)量和批次間的穩(wěn)定性。該系統(tǒng)不含人源細(xì)胞系，避免了生產(chǎn)過程中產(chǎn)生野生型HBV病毒顆粒的風(fēng)險(xiǎn)，安全性更高。此系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的生產(chǎn)，而且具有較高的產(chǎn)率和穩(wěn)定性。
? ? ?腺相關(guān)病毒產(chǎn)品采用碘克沙醇密度梯度離心純化，通過熒光定量PCR檢測(cè)AAV基因組ITR序列測(cè)定滴度（見圖3），并通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）銀染檢測(cè)產(chǎn)品純度，如圖4所示，rAAV-HBV1.3-mer WT replicon三條特征條帶清晰，純度≥97%。
圖3 通過qPCR檢測(cè)，rAAV8-1.3xHBV的滴度為1012?vg/mL。
圖4? SDS-PAGE銀染檢測(cè)rAAV-HBV1.3-mer WT replicon純度，AAV的外殼由VP1、VP2、VP3三種蛋白按1:1:10比例組成，大小分別是87 KD、73 KD、62KD，三條帶灰度值越接近上述比例，病毒純度越高。
四、產(chǎn)品信息
五、使用環(huán)境及注意事項(xiàng)
1、重組腺相關(guān)病毒屬于復(fù)制缺陷型假病毒載體，但rAAV-HBV1.3-mer WT replicon攜帶致病基因，其病毒產(chǎn)品和受感染的動(dòng)物對(duì)人具有感染性和致病性，應(yīng)在生物安全二級(jí)條件下操作使用，運(yùn)輸過程也需做到隔離防護(hù)。2、操作人員需要經(jīng)過專業(yè)的生物安全培訓(xùn)并獲得生物安全培訓(xùn)合格證，嚴(yán)格按照生物安全實(shí)驗(yàn)規(guī)程和手冊(cè)進(jìn)行操作。建議操作人員接種乙型肝炎疫苗以獲得乙肝免疫能力。
3、感染了rAAV-HBV1.3-mer WT replicon的小鼠排泄物等可能含有HBV病毒，該HBV病毒對(duì)包括人在內(nèi)的靈長類動(dòng)物有潛在感染性和致病性，對(duì)樹鼩、鴨子等動(dòng)物的均具有感染性，故實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及廢棄物的處理需要嚴(yán)格遵循生物安全實(shí)驗(yàn)規(guī)程。
4、該病毒產(chǎn)品及其動(dòng)物模型的使用單位應(yīng)該有生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室資質(zhì)。
六、運(yùn)輸及保存方法
1、病毒采用干冰運(yùn)輸，通常1-2天送達(dá)。
2、病毒可在4℃短期保存1-2周，但滴度會(huì)有4-5倍的降低。長期保存需存放于-80℃。每凍融一次，病毒滴度降低10%左右，應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3、理論上，病毒可于-80℃保存6個(gè)月以上，但病毒儲(chǔ)存時(shí)間超過6個(gè)月后，建議在使用前重新測(cè)定滴度。
4、分裝保存，避免反復(fù)凍融。
5、避免細(xì)菌、蛋白酶等污染。
七、參考文獻(xiàn)
[1] Ganem D. Hepadnaviridae. The viruses and their replication [M] . // Fields B N,Knipe D M, Howley P M. Fields virology. 3rded. Philadelphia: Lippincott-Raven Publisher, 1996: 2703-2737.
[2] GLOBAL HEPATITIS REPO RT. 2017.
[3] Chronic Hepatitis B Virus Infection: Developing Drugs for Treatment Guidance for Industry. FDA. 2018.
[4] Haifeng Wang, Seahee Kim, and Wang-Shick Ryu. DDX3 DEAD-Box RNA Helicase Inhibits Hepatitis B Virus Reverse Transcription by Incorporation into Nucleocapsids. Journal of General Virology (2009). 5815-5824.
[5] Man-Young Cha, Dong-Kyun Ryu. Stimulation of hepatitis B virus genome replication by HBx is linked to both nuclear and cytoplasmic HBx expression. Journal of General Virology (2009). 90: 978-986.