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?GST Pull-down實驗

摘要：體外利用GST-PES1六種突變體蛋白（1-588aa全長，1-415aa， 322-455aa缺失，322-588aa，220-588aa，101-588aa）與His-NPM1的pull-down實驗，確定PES1的220-322aa區域是與NPM1相互作用的結構域。為進一步研究PES1的功能提供實驗數據。
關鍵詞：PES1，NPM1，Pull-down， 蛋白相互作用，原核表達

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一、?實驗原理
利用重組技術將PES1蛋白與GST （Glutathione S transferase） 融合表達，融合蛋白通過GST與瓊脂糖微球上結合的GTH （Glutathione）親和結合。因此，如果PES1與NPM1之間有直接相互作用，當結合了PES1蛋白的GTH微球的與含有NPM1蛋白的細胞裂解液混合孵育，再通過離心富集GST微球，得到的樣品中可以檢測到NPM1。

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二、?實驗目的
在體外檢測?NPM1 (nucleophosmin )與PES1（pescadillo）之間的直接相互作用，確定PES1與NPM1相互作用的結構域。

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三、?實驗步驟
1.?6×His-NPM1（pET-28a）質粒轉化BL21-DE3感受態細胞：
2.?培養誘導蛋白表達 ：
1)?挑取6×His-NPM1單克隆菌落到5ml培養基（含amp抗生素）。
2)?搖床37℃培養12-15h。按照1:100比例接種到50ml的培養基（含amp抗生素）。
3)?37℃培養到OD600吸光光度值0.6-0.8（大概2.5-3h）。
4)?加入100mM IPTG至終濃度1.0mM誘導表達。
5)?低溫（30℃）繼續誘導培養2-4h。
6)?轉移菌液到離心管，7700 g離心10min。棄去上清，在冰上控干。
7)?沉淀重懸在2.5ml PBS中。取10μl留用SDS-PAGE分析。
3.?裂解細胞：
1)?加入25 μl lysozyme（10 mg/ml in ddH2O）。利用干冰或者液氮凍融三次。 適宜條件下超聲使菌液變得澄清。
2)?12,000g 4℃離心15min，上清轉移到新的離心管。
4.?準備glutathione sepharose 4B beads，結合GST融合蛋白：
1)?將sepharose 4B搖動后使其重懸。
2)?取 500μl sepharose 4B beads，使用10ml PBS徹底清洗3次以去除乙醇。
3)?500g離心5min去除上清。
4)?使用500μl PBS重懸Sepharose 4B beads。
5)?每樣品取20μl Sepharose 4B beads， 加入1ml binding buffer，再加入5μg純化的GST對照蛋白，1-588aa全長GST-PES1
蛋白，1-415aa， 322-455aa缺失，322-588aa，220-588aa，101-588aa。
6)?室溫混合孵育1h。
5.?Pull-down 實驗：
1)?每樣品中加入His-NMP1誘導表達裂解液100μl。
2)?4℃混合過夜。
3)?500g離心5分種棄去上清。
4)?使用lysis buffer洗滌3-4 次。
5)?加入2x SDS上樣液，煮樣品10min。
6.?Western Blot分析結果：
使用anti-his標簽抗體檢測 。

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四、?實驗結果

??????????????????????????????????????????????????????????????????????? 圖1. GST-PES1各種突變體示意圖

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????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 圖2. GST Pull-down結果

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從圖2的結果可以看到，PES1的220-322aa之間的結構域是與NPM1相互作用必須的。

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五、?參考文獻
1.?Zhang J, Yang Y, Wu J. B23 interacts with PES1 and is involved in nucleolar localization of PES1. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 2009; 12: 991-997.

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