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? ? 最近科研界什么比較流行？外泌體（Exosomes）是當之無愧的熱點話題。不論在腫瘤領域、神經科學領域還是代謝領域，都有大量的外泌體相關文章發表，以探究外泌體的功能和機制。
?? 再梳理一下外泌體的基本知識。外泌體是一類大小為30-150nm、呈茶托狀的由脂質雙層膜包裹的細胞外囊泡，廣泛存在于細胞培養上清及各種體液中，包括血液、淋巴液、唾液、尿液、卵泡液、精液、心包液、乳汁等。外泌體內含有多種蛋白質（如TSG101、HSP70等）、核酸（DNA、RNA）和脂質（膽固醇、鞘磷脂等），這些內容物因釋放外泌體的細胞不同而有比較大的差異。
?? 外泌體首先需要從樣本中分離出來，目前比較公認的分離方法是超速離心法，再通過透射電鏡（TEM）、納米粒徑跟蹤分析（NTA）、Western Blot等進行鑒定。獲得外泌體后，對外泌體進行標記，觀察外泌體被攝取情況，再進一步探索外泌體的功能，如組織修復、腫瘤轉移、代謝重建等。下面我們仔細聊一聊外泌體標記的方法：

一、親脂性染料標記：
目前已發表的外泌體文章中，外泌體大多使用親脂性染料進行標記，體內和體外都較多應用。親脂性染料主要分為兩大類，一類是PKH67（綠色熒光）/PKH26（紅色熒光），由于它們可以與外泌體的脂質雙層膜穩定結合，所以染色效果較好，應用較廣泛。

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?? 二類是Di系列的親脂性染料，包括DiI（橙色熒光）、DiO（綠色熒光）、DiD（紅色熒光）、DiR（深紅色熒光）。其中DiR的紅外熒光可穿透細胞和組織，在活體成像中用來示蹤。

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圖五DiR標記的外泌體再尾靜脈注射小鼠結腸癌腫瘤模型
J Nanobiotechnology. 2020 Jan 9;18(1):10.

二、慢病毒介導CD63-GFP表達：
?? 將外泌體的特定蛋白CD63和綠色熒光蛋白GFP的表達元件構建成質粒再包裝到慢病毒中，隨后用此慢病毒感染細胞，使細胞分泌的外泌體帶有綠色熒光。

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圖六 用GFP標記的外泌體分別與SH-SY5Y、BV2和DRG細胞共培養
Artif Cells NanomedBiotechnol. 2019 Dec;47(1):2918-2929.
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圖七 注射有CD63-GFP的外泌體后觀察第1天(D1)和第5天(D2)的熒光
Artif Cells NanomedBiotechnol. 2019 Dec;47(1):2918-2929.

三、用金納米顆粒（gold nanoparticles，GNPs）標記：
?? 將金顆粒標記的外泌體通過鼻內給藥不僅能進行無創跟蹤，而且能促進外泌體在腦部的積累和延長在病變區域的存在時間，增強體內神經成像的效果。因此，這種外泌體標記技術可以作為多種腦疾病的強大診斷工具，并可能增強基于外泌體的神經恢復治療。

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圖八 金納米顆粒外泌體的制備及體內注射
ACS Nano. 2017 Nov 28;11(11):10883-10893.
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圖九用金顆粒和PKH26對外泌體進行雙標記
ACS Nano. 2017 Nov 28;11(11):10883-10893.

四、用近紅外（NIR）熒光探針進行標記：
?? 這是一種使用兩親性探針對NIR熒光標記的外泌體進行內源性檢測的方法，無需對外泌體進行免疫標記或合成或色譜處理。由于NIR波長的熒光探針能穿透體內組織，從而提供了從細胞直接轉換到體內使用的好處。

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五、用Gaussia luciferase（gluc）和截斷的lactadherin進行標記：
?? 將gLuc-lactadherin構成融合表達的質粒，再將此質粒轉染細胞，使細胞分泌的外泌體帶有強的螢光素酶活性。將標記的外泌體進行靜脈注射入小鼠體內，看外泌體在組織的分布情況。

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J Biotechnol. 2013 May 20;165(2):77-84.

文章總結：
外泌體標記對探究外泌體的功能是必不可少的一個步驟，首先需要觀察到外泌體被受體細胞吸收或到達目的組織、器官，再檢測受體細胞、組織或器官中相應指標的變化，看外泌體是否具有一定的功能。確定外泌體具有功能后，再通過高通量測序或基因芯片進行差異表達分子的挖掘，進一步深入研究機制。