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Hieff NGS^® Fast-Pace DNA Cyclization Kit for MGI^®是針對 MGI^®高通量測序平臺專門開發(fā)設(shè)計的單鏈環(huán)化試劑盒。本產(chǎn)品采用高質(zhì)量的酶和經(jīng)優(yōu)化后的 buffer 組成，顯著提高反應(yīng)效率，使整個環(huán)化消化流程在 30 min 內(nèi)完成。本試劑盒適用于所有連接華大標(biāo)準接頭的文庫擴增產(chǎn)物， 除建庫試劑本身的限制外，本環(huán)化試劑盒不限 MGI^®測序平臺。

產(chǎn)品組分

運輸與保存方法

冰袋運輸。所有組分-20°C保存，有效期1年。

注意事項

一、關(guān)于操作

1. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

2. 請于使用前將試劑盒各組分置于室溫解凍。解凍后上下顛倒數(shù)次充分混勻，短暫離心后置于冰上待用。

3. 配制各步驟反應(yīng)液時推薦使用移液器吹打混勻或輕輕振蕩，劇烈振蕩可能會造成文庫產(chǎn)出下降。

4. 為避免樣品交叉污染，推薦使用帶濾芯的槍頭，吸取不同樣品時請更換槍頭。

5. 推薦在帶熱蓋的PCR儀中進行各步驟反應(yīng)，使用前應(yīng)預(yù)熱PCR儀至反應(yīng)溫度附近。

6. 定時對各實驗區(qū)域進行清潔（使用0.5%次氯酸鈉或10%漂白劑進行擦拭清理），以保證實驗環(huán)境的潔凈度。

7. 本產(chǎn)品僅作科研用途！

二、樣本要求及處理

2.1樣本量要求

1. 本試劑盒推薦的Input DNA量為1 pmol；若PCR產(chǎn)物不足，最低可降至0.5 pmol投入量。

2. 若有特殊的環(huán)化投入量需求，則按照文庫制備試劑盒的要求投入所需的 Input DNA 量。

3. 不同片段大小DNA 1 pmol 分子對應(yīng)不同的質(zhì)量，可根據(jù)公式 1 計算或參考表1選擇所需的 Input DNA量：

公式 1 PCR 產(chǎn)物摩爾數(shù)與質(zhì)量間的換算

1 pmol PCR 產(chǎn)物對應(yīng)的質(zhì)量 (ng)=DNA 主片段大小 (bp)×0.66

表1  不同片段大小PCR產(chǎn)物1pmol對應(yīng)產(chǎn)量

2.2 樣本混樣要求

1. Input DNA可以是單個樣本，也可以是多個帶有不同Barcodes的樣本的混合物。

2. 對樣本進行混合時需滿足Barcodes混合的要求，可參考表Adapters試劑盒說明書選擇合適的Barcodes進行混合。

3. 混合的樣本總量推薦為1 pmol，若每個樣本所需數(shù)據(jù)量相同，則等量混合，每個樣本所需的質(zhì)量按照公式2進行計算：

公式 2 混合樣本中單個樣本所需質(zhì)量的計算

單個樣本所需的質(zhì)量(ng)=1 pmol Input DNA對應(yīng)的質(zhì)量（ng）/混合的樣本個數(shù) N

4. 單個樣本或混合后樣本用于環(huán)化時，體積應(yīng)為34 μL，若不足則用 ddH₂O補充至34 μL。

三、關(guān)于磁珠純化（Bead-based Clean Up）

1. 磁珠使用前應(yīng)先平衡至室溫，否則會導(dǎo)致純化得率下降。

2. 磁珠每次使用前都應(yīng)充分振蕩混勻或使用移液器上下吹打充分混勻。

3. 磁珠漂洗使用的80%乙醇應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，否則將影響回收效率。

4. 產(chǎn)物洗脫前應(yīng)將磁珠置于室溫干燥。干燥不充分容易造成無水乙醇殘留影響后續(xù)反應(yīng)；過分干燥又會導(dǎo)致磁珠開裂進而降低純化得率。通常情況下，室溫干燥約5 min。

5. 單鏈環(huán)產(chǎn)物純化保存，可使用TE Buffer洗脫，產(chǎn)物可于-20°C可保存1個月。

四、關(guān)于文庫質(zhì)檢（Library Quality Analysis）

1. 單鏈環(huán)產(chǎn)物純化后推薦使用 Qubit^® ssDNA Assay Kit 單鏈DNA熒光染料試劑對純化后產(chǎn)物進行定量。  

2. 針對華大智造高通量測序平臺， 單鏈環(huán)產(chǎn)物純化后產(chǎn)量應(yīng)≥80 fmol（足夠2次上機測序）。

3. 可根據(jù)公式3計算或參考表2。

公式 3 單鏈環(huán)摩爾數(shù)與質(zhì)量間的換算

80 fmol單鏈環(huán)對應(yīng)的質(zhì)量(ng)=0.08×DNA 主片段大小(bp)×0.33

表2  不同PCR產(chǎn)物片段大小對應(yīng)80fmol單鏈環(huán)產(chǎn)量

使用方法

一、自備材料

1. 純化磁珠：Cat#12601，Hieff NGS^® DNA Selection Beads或Cat#A63880，AMPure XP Beads或其他等效產(chǎn)品。

2. 文庫質(zhì)控：Cat # Q10212, Thermo fisher Qubit^® ssDNA Assay Kit。

3. 其他材料：無水乙醇、滅菌超純水、TE Buffer（10 mM Tris-HCl，pH 8.0-8.5+0.1 mM EDTA）、低吸附EP管、PCR管、磁力架、PCR儀等。
二、操作流程

圖1  單鏈環(huán)化文庫構(gòu)建流程

三、操作步驟

3.1 變性

1. 根據(jù)文庫長度，取1 pmol 至0.2 ml PCR管中，用ddH₂O補充至34 μL。

2. 將表3中試劑解凍后，顛倒混勻并置于冰上備用。

3. 于冰上配制表3反應(yīng)體系。

表3  DNA變性體系

4. 混勻后，在PCR儀上進行98℃變性3 min，之后立即置于冰上，冰浴2 min 后瞬時離心。

3.2 單鏈環(huán)化

1. 將表4中各試劑解凍后，顛倒混勻，置于冰上備用。

2. 于冰上配制表4反應(yīng)體系。

表4  單鏈環(huán)化體系

3. 使用移液器輕輕吹打或低速振蕩混勻，并短暫離心將反應(yīng)液離心至管底。

4. 將PCR管置于PCR儀上，按照表5所示設(shè)置反應(yīng)程序，進行單鏈環(huán)化反應(yīng)。

表5單鏈環(huán)化反應(yīng)程序

3.3 酶切消化

1. 將表6中各試劑解凍后，顛倒混勻，置于冰上備用。

2. 于冰上配制表6所示反應(yīng)體系。

表6  酶切消化體系

3. 使用移液器輕輕吹打或低速振蕩混勻，并短暫離心將反應(yīng)液離心至管底。

4. 將PCR管置于PCR儀上，按照表7的條件進行反應(yīng)：

表7  酶切消化反應(yīng)程序

5. 反應(yīng)結(jié)束后，瞬時離心，立即進行純化。

3.4 消化產(chǎn)物純化

該步驟使用磁珠對3.3步驟的產(chǎn)物進行純化。

1. 準備工作：將Hieff NGS^® DNA Selection Beads或 Beckman AMPure XP Beads由冰箱中取出，室溫平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。

3. 吸取120 μL Hieff NGS^® DNA Selection Beads至消化產(chǎn)物中，渦旋或吹打混勻，室溫孵10min。

4. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約2 min），小心移除上清。

5. 保持PCR管始終置于磁力架中，加入200μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重復(fù)步驟5，總計漂洗兩次。

7. 保持PCR管始終置于磁力架中，開蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂。

8. 將PCR管從磁力架中取出，加入22 μL TE Buffer，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置10 min。

9. 短暫離心，將 PCR 管始終置于磁力架中靜置，待溶液澄清后（約 2min），將上清小心移至新 PCR 管中。

★停止點：環(huán)化純化產(chǎn)物，可置于-20℃儲存一個月。

3.4 消化產(chǎn)物質(zhì)控

使用Qubit^® ssDNA Assay Kit熒光試劑對酶切消化產(chǎn)物進行定量，具體請參見注意事項四。

HB220426