流式細胞術檢測細胞凋亡

備用試劑
1. 結合緩沖液(10X ): 0.1 M HEPES, pH 7.4; 1.4 M NaCl; 25 mM CaCl2 . 稀釋到1X 工作液備用;
2. 碘化丙碇Propidium Iodide (PI).?? 用PBS稀釋到50 μg/ml備用,建議與Annexin V-FITC聯合使用;
3. 7-AAD. 推薦與Annexin V-PE或者Annexin V-Biotin 聯合使用;
4. 1X PBS? 室溫儲存備用;

染色步驟
1、用預冷的PBS洗滌細胞兩次,之后用1X的結合緩沖液重懸細胞, 調節細胞濃度到1X106Cells/ml;
2、取100μl調節好濃度的細胞懸液到5ml流式管底部;
3、加入Annexin V標記蛋白和相應的核酸染料(標記的Annexin V與核酸染料均需要摸索到合適的使用濃度,商品化試劑盒按照說明書操作);
4、均勻混合,室溫避光反應15分鐘;(若是用Annexin V-Biotin標記蛋白染色,反應后用1X的結合緩沖液洗滌細胞一次,再加入合適濃度的標記鏈霉親和素Streptavidin,再加入合適的核酸染料,室溫避光反應15分鐘)
5、向流式管中加入400μl 1X的結合緩沖液,重懸后及時上流式細胞儀進行分析.

操作注意事項

1、補償對照管很重要;
2、細胞處理需要小心操作,盡量避免人為的損傷細胞;
3、細胞濃度與染色用的蛋白量要合適;
4、對不同藥物濃度和藥物作用時間要進行摸索;

儀器：

實驗所用的流式細胞儀為COULTER EPICS XL。

送檢樣本量：

1）單個細胞：1~2×106 個細胞左右;來源于人、小鼠、大鼠或其它。

2）外周血：EDTA或肝素抗凝全血，5ml左右;來源于人、小鼠、大鼠或其它。

1、 部分常用熒光探針，如PI等，我公司可免費提供，;特殊標記物，如CD抗體等，用戶須另行購買，也可委托我公司代購;用戶所提供抗體應可與樣本發生特異性識別反應。

2、由用戶提供的樣品或試劑所致的實驗問題由用戶負責。

附：流式細胞術檢測樣品推薦制備方法：

細胞周期、細胞凋亡及DNA倍體分析樣品（PI染色）的制備：

（1）待測樣本制成單細胞懸液，然后200g離心5分鐘，棄上清。

（2）用4℃預冷的70%冷乙醇固定，4℃保存，至少固定18小時。

（3）調整細胞濃度為106細胞/毫升，取1毫升細胞懸液，用PBS洗三次，細胞重懸于1毫升PI染液中，37℃孵育30分鐘即可進行流式分析。

（4）PI染液終濃度為50微克/毫升，RNase A終濃度為20微克/毫升。

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