AH109酵母感受態細胞

保存條件：-80℃。

1.產品簡介：

AH109菌株來源于PJ69-2A酵母菌株，將lacZ報告基因引入PJ69- 2A誕生了AH109，此菌株是Clontech公司開發的GAL4系統酵母雙雜實驗用菌株，MATa型，可直接轉化質?；蚺cMATa型酵母菌株Y187通過mating操作進行蛋白互作驗證或篩庫試驗。Transformation marker為: trp1， leu2，報告基因為: lacZ,HIS3，ADE2，MEL1。 AH109 -GAL4酵母雙雜系統需要兩種質粒配套使用:PGBKT7和PGADT7。質粒PGBKT7的篩選標志為TRP1，用于表達DNA-BD(來自酵母轉錄因子GAL4N端1~ 174位氨基酸)與目標蛋白(Bait)的融合蛋白;質粒PGADT7的篩選標志為LEU，用于表達AD(GAL4 C端768^ 881 位氨基酸)與目標蛋白(Prey) 的融合蛋白。GAL4系統原理:一個完整的酵母轉錄因子GAL4可分為功能上相互獨立的兩個結構域:位于N端1~ 174位氨基酸 區段的DNA結合域(DNA-BD) 和位于C端768^ 881 位氨基酸區段的轉錄激活域(AD)。DNA-BD能夠識別GAL4- responsive gene的上游激活序列UAS，并與之結合。而AD可以啟動UAS下游的基因進行轉錄。BD和AD單獨存在不能激活轉錄，但當二者接近時，則呈現完整的GAL4活性，使含有UAS的啟動子下游基因轉錄表達。正常條件下，BD不與AD結合，將要檢測的蛋白質分別與BD和AD融合，形成bait融合蛋白(bait -BD) 和prey融合蛋白(prey-AD) ，如果bait和prey發生相互作用，就會促使BD和AD的相互接近，形成完整的GAL4，從而激活報告基因的轉錄。AH109有 四個報告基因: lacZ, HIS3， ADE2， MEL1， 分別由三種不同的啟動子(GAL1，GAL2， MEL1)啟動，這三種啟動子只有GAL4識別的17bp核心區相同，其余部分均不同，大大降低了酵母雙雜假陽性發生的概率。AngYuBio Hi gh5TM系列AH109感受態細胞經特殊工藝制作，經PGADT7質 粒檢測轉化效率>10⁴cfu/ug DNA。

基因型：MATa，trp1-901， leu2- 3，112，ura3-52， his3-200，gal4 △,gal80△,LYS2 : :GAL1UAS- -GAL1TATA-HIS3，MEL1 GAL2UAS-GAL2TATA-ADE2，URA3: : MELIUAS-MEL1TATA-lacZ

2.使用說明：

1).取一支無菌的1.5ml EP管，依次加入預冷的目的質粒1-3μg, .Carrier DNA 10μl(95-100℃ 5min快速冰浴，重復一次)，100μl冰.上融化的AH109感受態細胞，PEG/LiAc 500ul， 輕輕翻轉混勻6-8次;

2).30℃ 水浴30min，每10min輕輕翻轉混勻6-8次;

3).每支加入20ul的二甲基亞砜; (用于提高轉化效率，可不做)

4).42℃水浴15min，每5min輕輕翻轉混勻6- 8次;

5).12000rpm瞬時離心棄上清,每支加入1m1的YPD Plus于30℃復蘇1h; (用于提高轉化效率， 可不做)

6).12000rpm瞬時離心棄上清，用100ul 0.9% NaCl 重懸，涂板,30℃培養48 - 96h。

3.注意事項：

1).感受態細胞最好在冰上融化, PEG溶液在低溫環境下會析出，請于常溫下完全溶解后使用。

2).轉化高濃度的質?？上鄳獪p少最終用于涂板的菌量。

3).同時轉化2-3種質粒時可增加質粒的用量。

4).AHA109酵母菌株對高溫敏感，最適生長溫度為27-30℃;高于31℃，生長速度和轉化效率呈指數下降。

5).菌落變粉不是污染，是酵母細胞生長中一個常見現象。當細胞在平板培養幾天后，平板上的Adenine被酵母消耗完畢，酵母試圖通過自身代謝途徑合成Adenine以供利用，然而，有些菌株的ADE2基因被破壞，Adenine合 成途徑受阻;又由于其.ADE4,5, 6, 7, 8基因均正常，所以造成中間產物P-ribosylaminomidazole (AIR) 在細胞中積累而使菌落變為粉紅色。

6).酵母在缺陷培養基中生長速度比YPDA培養基慢，培養基中缺陷成分越多，生長越慢，以轉化涂板為例:涂YPDA平 板29℃，48h培養可見直徑1mm克隆;涂SD單缺平板29℃，48- 60h培養可見直徑lmm克隆，涂SD雙缺平板29℃，60- 80h培養可見直徑1mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培 養可見直徑lmm克隆。

*本試劑僅供實驗室研究使用