產品簡介

Viability/Cytotoxicity Multiplex Assay Kit 活力/細胞毒性測定試劑盒含兩種熒光染料 DMAO 和 EthD-III， 可分別將活細菌染成綠色 ，將死細菌染成紅色。

DMAO 是一種綠色核酸熒光染料 ，可染色活細菌和死細菌。EthD-III 是一種紅色核酸熒光染料 ，僅染色細  胞膜受損的死細菌。將 DMAO 和 EthD-III 混合對細菌進行染色時 ，具有完整細胞膜的活細菌呈現綠色 ，而 具有受損細胞膜的死細菌呈現綠色和紅色。通過熒光顯微鏡或流式細胞儀等來分析染色后的細菌 ，以此判 斷細菌的活死狀態。適用于大多數細菌類型。

細菌活力通常指細菌在合適的培養基中繁殖的能力 ，對其的測定稱為生長測定。該試劑盒與在液體或固體 培養基中進行的細菌生長測定結果具有較好的一致性。但在某些條件下 ，膜損傷的細菌可能會在營養培養 基中恢復并繁殖 ，而這些細菌在試劑盒測定中可能會被判為死亡。相反 ，一些具有完整膜的細菌可能無法 在營養培養基中繁殖 ，但這些細菌在試劑盒測定中可能被判為存活。因此 ，如果發現該試劑盒檢測和細菌 生長測定之間有相當大的差異 ，應該考慮上述可能性。

光譜特性 DMAO： Ex/Em=503/530nm（with DNA） ；EthD-III：Ex/Em=530/620nm（with DNA）

組分信息

儲存條件

冰袋運輸。儲存于 4ºC ，至少可以儲存 6 個月。

注意事項

1.     為了您的安全和健康 ，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

2.     本產品僅用于科研。

使用說明

1.     活、死細菌樣品對照制備（可選）

1)     在液體培養基中培養 4 mL 的細菌至晚期對數期。

2)     在 EP 管中準備兩份 1 mL 的細菌液 ，并在 5,000-10,000g 條件下離心 10-15 min。

3)     去除上清液 ，在其中一支 EP 管中加入 0.3 mL 的 0.85% NaCl 重懸細菌 ，在另一管中加入 1 mL 的

0.85% NaCl 重懸細菌。 

4)     在含有 0.3 mL 的 0.85% NaCl 的管中加入 0.7 mL 異丙醇 ，充分混合（最終濃度為 70% 的異丙醇） 用以制備死細菌樣品。

5)     將兩種樣品在室溫下孵育 1 h ，每 15 min 混合一次。

6)     兩種樣品在 5,000-10,000g 條件下離心 10-15 min。

7)     去除上清 ，在兩種樣品中加入 1 mL 的 0.85% NaCl 重懸細菌 ，并如步驟 6 再次離心。

8)     使用分光光度計測定兩種菌懸液在 670 nm 處的吸光值（OD670）。

9)     將兩種菌懸液（活的和死亡的）密度調整到 108 個細菌/ mL（OD670≈0.3） ，然后用 0.85%  的 NaCl 以 1：100 稀釋 ，使最終密度為 106 個細菌/ mL。

10)   如下表所示混合兩種菌懸液以獲得所需的活細胞：死細胞比率。

表 1 活、死菌懸液按一定體積混合以達到所需的活細胞、死細胞比例

2.     熒光顯微鏡的染色方法

1)     將 1 體積的 DMAO 和 2 體積的 EthD-III 在微量離心管中混合，充分混合后加入 8 體積的 0.85% NaCl 溶液以得到 100×染料溶液。

2)     每 100  μL 菌懸液 ，加 1  μL 的 100×染料溶液。

3)     充分混合 ，室溫下在黑暗中孵育 15 min。

   4)     取 5  μL 染色后的菌懸液滴在帶有 18 mm 方形蓋玻片的載玻片上。

5)     在熒光顯微鏡下觀察。活細菌和死細菌的熒光可以在任何標準的 FITC 長效過濾器下同時觀察到。或

者 ，活的（綠色熒光）和死的（紅色熒光）細菌可以分別用 FITC 和 Cy3（或 TexasRed）通道觀察。

注意：

1)     在對細菌染色之前，必須注意去除殘留的生長介質。核酸和其他培養基組分可以某種方式結合 DMAO 和 EthD-III 染料，導致不可接受的染色變化。簡單的洗滌步驟通常足以從細菌懸浮液中除去干擾介質 組分。不建議使用磷酸鹽緩沖液 ，因為它們會降低染色效率。

2)     在開始正式實驗前應調節染料濃度來使 DMAO 標記活細菌、使 EthD-III 標記死細菌進行區分。最佳濃 度可能因細菌菌株的不同而異。一般最好使用能夠提供充足信號的最低染料濃度。

3.     細胞流式的染色方法

實驗開始前 ，請閱讀熒光顯微鏡染色步驟下的注意事項。

1)     根據表 1 ，在 EP 管中加入 11 種不同比例的活細菌和死細菌。11 種樣品中每種的體積 1 mL。

2)     將 12  μL 的 DMAO 儲備溶液與 24  μL 的 EthD-III 儲備液在微量離心管中混合。11 個樣品中的每個加 入 3  μL 的混合染料 ，通過上下吹打幾次徹底混合。（注意：需要準備另外的對照細菌樣品用于單獨 的 DMAO 和單獨的 EthD-III 染色）

3)     室溫下在黑暗中孵育 15 min。

4)     使用流式細胞儀分析每個樣品，使用 DMAO 陽性細胞的 FITC 通道和 EthD-III 陽性細胞的 PI 或 PE 通 道。