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人Oct-4基因干擾慢病毒有效靶點驗證實驗

摘要：本實驗使用qPCR和Western Blot實驗驗證4個針對人Oct-4基因干擾慢病毒的干擾效果。實驗結果表明與陰性對照比較PY1002慢病毒的干擾效率在mRNA和蛋白水平分別達到90%和80%以上。
關鍵詞：RNAi，Oct-4，qPCR，Western Blot

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一、?實驗原理
由于基因轉錄后的mRNA高級結構的存在以及序列SNP位點，mRNA翻譯效率等諸多因素的影響，設計的RNA干擾靶點最終在蛋白水平的干擾效果也不盡相同。使用qPCR以及Western Blot對RNA干擾靶點的效果進行檢測可以獲得有效的干擾靶點，為后續的基因功能提供實驗基礎。

二、?實驗目的
使用qPCR以及Western Blot對RNA干擾靶點的效果進行檢測以獲得有效的干擾靶點，為后續的基因功能提供實驗基礎。

三、?實驗步驟
1.?準備細胞：
1)?細胞鋪板：
將PANC-1細胞按30%的融合度接種到6孔板：
a)?PANC-1細胞配成4×105 cells/ml細胞懸液，待鋪板。
b)?每孔鋪2×105 cells/well，鋪2塊6孔板。
2)?感染慢病毒：
12~20h后感染Oct-4干擾慢病毒及對照慢病毒：
a)?根據公式計算病毒用量： （細胞數×MOI值/病毒原液滴度）×103=病毒用量（μl）。
b)?本實驗中MOI取50，吸去與加入病毒體積相同培養基。
c)?每孔加2.5μl的polybrene (1mg/ml)，使polybrene終濃度達到5μg/ml。
d)?24h后換，棄去培養基后每孔加入1.5ml新鮮的培養基。
e)?48h后收集細胞，一塊6孔板抽提RNA，備用。
f)?72h后另一塊6孔板制備蛋白樣品，備用。?
2.?Real-time PCR：
1)?總RNA抽提：
說明：根據Invitrogen公司的Trizol操作說明書進行，均為RNase-free操作。
a)?離心去細胞上清，每孔加入1000μl Trizol，吹打，室溫靜置5min，后轉移至另一新的1.5 ml 離心管中。
b)?每管加入200 μl氯仿，用力震蕩15s，室溫靜置15min。??
c)?4℃，12000 rpm，離心15min。??
d)?從每管中吸取上清至另一新的1.5 ml 離心管。加入等體積異丙醇，混勻后4℃沉淀 10 min。??
e)?4℃，12000 rpm離心10 min后，去上清。
f)?加入至少1 ml 4℃預冷的75%乙醇，洗滌沉淀及離心管壁。
g)?4℃，10000 rpm離心5 min，棄上清。
h)?4℃，10000 rpm再次離心5 min，吸去殘液，室溫干燥（不需完全干燥）。
i)?加入20 μl RNase-free水，至完全溶解，紫外分析測定所抽提RNA的濃度。
2)?RNA逆轉錄獲cDNA：
M-MLV逆轉錄酶和dNTP購自PROMEGA公司。Oligo dT購自上海生工。RNase -free的物品都購自Axygen。
說明：根據Promega公司的M-MLV操作說明書進行， 均為RNase－free操作。
a)?將1 μl Oligo dT(0.5μg/μl) 和2.0μg Total RNA加入到PCR小管中，補充DEPC-H2O至9μl?；靹蚝箅x心，70℃溫浴10min。 之后立即插入到0℃冰水浴中，使Oligo dT和模板退火。
b)?按下表的比例，根據反應管數算出所需的試劑量。將M-MLV酶等在冰上混勻，得到RT反應液。
c)?在每個反應管中加入的11μl的RT反應液，混勻后離心。

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d)?RT反應在42℃進行1h后完成，之后用70℃處理10min使RT酶失活。
e)?得到的RT反應產物-cDNA可立即用于PCR，也可保存在-80℃以后使用。

3)?Real-time PCR檢測：
按下列比例配置反應體系 ：
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a)?設定程序為兩步法Real-Time定量。預變性95℃，15s，之后每一步變性95℃，5s，退火延伸60℃，30s，共進行45個循環。每次在延伸階段讀取吸光值。

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Cycle 1: (1X)
Step 1:?? 95.0 ℃?? for 00:15.
Cycle 2: (45X)
Step 1:?? 95.0 ℃?? for 00:05.
Step 2:?? 60.0 ℃?? for 00:30.
Data collection and real-time analysis enabled.

b)?制作熔解曲線。PCR結束后， 在95℃變性1min。然后冷卻至55℃，使DNA 雙鏈充分結合。從55℃開始到95℃，每一步增加0.5℃，保持4s，同時讀取吸光值。

Cycle 3: (1X)
Step 1:?? 95.0 ℃?? for 01:00.
Cycle 4: (1X)
Step 1:?? 55.0 ℃?? for 01:00.
Cycle 5: (81X)
Step 1:?? 55.0 ℃-95.0 ℃? for 00:04.
Increase set point temperature after cycle 2 by 0.5 ℃

3.?Western Blot：
1)?總蛋白抽提：
a)?從培養箱中取出細胞，棄去細胞培養液，PBS洗滌2次。
b)?棄去PBS，加入適量預冷的2×Lysis Buffer，配方：1M Tris-HCl（pH6.8）100mM，巰基乙醇 2%，甘油 20%，SDS 4%。
c)?細胞刮刮下細胞，將樣品轉移入離心管中，冰上裂解細胞10~15 min。
d)?超聲破碎儀破碎細胞（200 W共4次，每次5s，間隔2s）。
e)?混勻后，沸水浴煮5-10 min，4℃存放備用。
2)? SDS-PAGE：
a)?制膠：根據目的蛋白分子量大小配制不同濃度的膠，具體體系如下：
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b)?上樣：等膠凝固好后，拔去梳子，電泳緩沖液清洗上樣孔，將準備好的樣品上樣。
c)?電泳：30mA 2h。
3)?免疫印跡（濕轉）：
電泳結束后，使用轉移電泳裝置，在4℃，400 mA恒流條件下電轉120min，將蛋白轉移到PVDF膜上。
4)?免疫顯色：
a)? 封閉：用封閉液（含5%脫脂牛奶的TBST溶液）室溫封閉PVDF膜1h。
b)? 一抗孵育：封閉液稀釋抗體，然后與封閉好的PVDF膜室溫孵育4℃過夜。
c)? 洗膜：TBST洗膜3次，每次10min。
d)? 二抗孵育：用封閉液稀釋相應的二抗，室溫下孵育PVDF膜2h。
e)? 洗膜：TBST洗膜3次，每次10min。
f)? 采用Amersham公司ECL+prime Western blotting system試劑盒進行顯色。
g)? X光顯影：在暗房中進行獲得顯示條帶的膠片加ECL、曝光、顯影、定影的。
具體步驟如下：
i.?將PVDF膜置于平鋪好的保鮮膜上，以1：1的比例混合A液和B液，將混合液均勻滴加在PVDF膜上，避光反應3-5min。
ii.?將膜取出，稍微瀝干多余的ECL底物反應液，放入暗盒，鋪上保鮮膜（避免產生氣泡），放上X光片（避免X光片的移動），關??
上暗盒，曝光1-2min。
iii.?取出X光片，放入顯影液中，約1min后取出，在清水中漂洗幾秒鐘，后放入定影液中至少2min。
iv.?取出X光片，晾干，分析。

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四、?實驗結果
表1.定量數值及分析(2-ΔΔCt分析法)
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?????????????????????????????????????????????????????????????圖1. qPCR定量數值及統計分析結果
??????????????????????????????????????????????????????????????????????????? ***表示p<0.001

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?????????????????????????????????????????????????????????????????圖2. Western blot

?從以上數據可以看到，在PANC-1細胞中，四個干擾慢病毒對Oct-4基因均有一定程度的干擾作用，其中PY1002慢病毒的干擾效率在mRNA和蛋白水平分別達到90%和80%以上。

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五、?參考文獻
1.?F.M.奧斯伯等著，馬學軍等譯，精編分子生物學實驗指南（第四版），科學出版社

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