新冠病毒RBD[E484K,K417T,N501Y]蛋白ELISA檢測試劑盒

【雙夾心酶聯免疫定量法】

產品貨號：EKnCov-RBD-04

（實驗前請仔細閱讀產品說明書）

聲明：尊敬的客戶，感謝您選用本公司的產品。本試劑盒僅供體外研究使用、不用于臨床診斷!本試劑盒不含任何具有生物危害成分，但是試劑盒使用涉及的檢測樣本請在具有相應生物安全防護等級實驗室進行，由此可能造成的所有生物安全危害由使用者自行負責。

本產品適用于體外定量檢測人血清、血漿，細胞培養液或其它相關生物液體中新冠病毒（SARS-Cov-2）N蛋白含量。使用前請仔細閱讀說明書并檢查試劑組分！如有疑問，請及時聯系我們。

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試劑盒組成：

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特別說明：

1.打開包裝后請及時檢查所有物品是否齊全完整。

2.一周內使用可存于4℃，需長時間保存或多次使用請按保存條件存放。

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檢測原理:

本試劑盒為雙抗體夾心法檢測抗原RBD[E484K,K417T,N501Y]蛋白，酶標板采用高親和力抗RBD[E484K,K417T,N501Y]蛋白抗體作為包被物，檢測時酶標板孔加入待檢樣品或標準品（哺乳動物重組表達RBD[E484K,K417T,N501Y]蛋白），再加入生物素化抗RBD[E484K,K417T,N501Y]蛋白抗體,反應后加入鏈霉親和素HRP，最后加入單組份TMB底物液。 如果待檢樣品中含有RBD[E484K,K417T,N501Y]蛋白，TMB底物液在HRP催化下顯色，加入終止液終止顯色后，在酶標儀OD₄₅₀/OD₆₃₀讀取吸光值，吸光值大小與待檢測樣品中RBD[E484K,K417T,N501Y]蛋白濃度呈正相關，根據標準品濃度/吸光值繪制的標準曲線，可計算出待檢樣品中RBD[E484K,K417T,N501Y]蛋白含量。

注意：結構活性不佳的RBD[E484K,K417T,N501Y]蛋白可能不容易被本試劑盒檢出，例如原核重組表達的RBD[E484K,K417T,N501Y]蛋白可能無法被試劑盒檢出。

樣品收集:?

1.血清：全血樣品于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，收集血液的試管應為一次性的無熱原，無內毒素試管。

2.血漿：抗凝劑推薦使用EDTA-Na₂，樣品采集后30分鐘內于1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測。避免使用溶血，高血脂樣品。

3.組織勻漿：用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應9mL的PBS，具體體積可根據實驗需要適當調整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測。

4.細胞培養上清：取細胞培養上清于1000×g離心20分鐘，除去雜質及細胞碎片。取上清檢測。

5.其它生物樣品：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測。

6.樣品應清澈透明，懸浮物應離心去除。

7.樣品收集后若在1周內進行檢測的可保存于4℃，若不能及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃(1個月內檢測)，或-80℃（6個月內檢測），避免反復凍融。

8.如果您的樣品中檢測物濃度高于標準品最高值，請根據實際情況，做適當倍數稀釋（建議先做預實驗，以確定稀釋倍數）。

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試驗所需自備物品:

1.酶標儀(450nm波長濾光片)

2.高精度移液器，EP管及一次性吸頭：0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL

3.37℃恒溫箱，雙蒸水或去離子水

4.吸水紙

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檢測前準備工作:

1.請提前20分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫。

2.洗滌液配制：將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:25)。未用完的放回4℃。從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結晶，屬于正常現象，可用40℃水浴微加熱使結晶完全溶解后再配制洗滌液（加熱溫度不要超過50℃，使用時洗滌液應為室溫）。當日使用 。

3.標準品配制:濃度為10000pg/mL?然后根據需要用通用稀釋液?進行1：2倍比稀釋（注：不要直接在反應孔中進行倍比稀釋）。建議配制成以下濃度：10000、5000、2500、1250、625、312.5、156.25、0pg/mL，標準品&樣品稀釋液直接作為空白孔0ng/mL

4.生物素標記抗RBD[E484K,K417T,N501Y]蛋白抗體工作液：實驗前計算當次實驗所需用量（以100μL/孔計），用通用稀釋液稀釋100倍，實際配制時應多配制100-200μL；

5.鏈霉親和素HRP工作液：實驗前計算當次實驗所需用量（以100μL/孔計），用通用稀釋液稀釋100倍 ，實際配制時應多配制100-200μL；

6.TMB底物液:使用前，提前放置室溫平衡

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洗滌方法: ???????????????

1.自動洗板機：每孔加入洗滌液350μL，注入與吸出間隔60秒。

2.手工洗板：甩盡孔內液體，在潔凈的吸水紙上拍干，每孔加洗滌液350μL，浸泡1-2分鐘，吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體，在厚的吸水紙上拍干。

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操作步驟:

實驗開始前，各試劑均應平衡至室溫；試劑或樣品配制時，均需充分混勻，并盡量避免起泡。

1.加樣：分別設空白孔、標準品孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100μL，標準品孔分別加入依次梯度稀釋標準品，待測樣品孔加待測樣品100μL，給酶標板覆膜，37℃孵育60分鐘。為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。

2.棄去孔內液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，大約350μL/每孔，甩干并在吸水紙上輕拍將孔內液體拍干。立即每孔加入配好的生物素標記的抗RBD[E484K,K417T,N501Y]蛋白抗體工作液100μL（在使用前15 分鐘內配制），注意不要有氣泡，加樣時將樣品加于酶標板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。給酶標板覆膜，37℃孵育60分鐘。為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。

3.棄去孔內液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，大約350μL/每孔，甩干并在吸水紙上輕拍將孔內液體拍干；

4.立即每孔加入配好的鏈霉親和素HRP工作液100μL（在使用前15分鐘內配制），注意不要有氣泡，加樣時將樣品加于酶標板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。給酶標板覆膜，37℃孵育45分鐘;

5.棄去孔內液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，大約350μL/每孔，甩干并在吸水紙上輕拍將孔內液體拍干；

6.每孔加TMB底物溶液(TMB)100μL，酶標板加上覆膜37℃避光孵育15分鐘左右（根據實際顯**況酌情縮短或延長，但不可超過30分鐘。當標準孔出現明顯梯度時，即可終止）。

7.每孔加終止液100μL，終止反應，此時藍色立轉黃色。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。?

8.立即用酶標儀在 450nm 波長測量各孔的光密度（OD值）。應提前打開酶標儀電源，預熱儀器，設置好檢測程序。

9.實驗完畢后將未用完的試劑按規定的保存溫度放回冰箱保存至有效期結束。

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注意事項：

1.保存：試劑盒中各試劑請按說明書提示合理存放。在儲存及溫育過程中避免將試劑暴露在強光中。所有試劑瓶蓋須旋緊以防止蒸發和微生物的污染，否則可能會出現錯誤的結果。

2.酶標板：剛開啟的酶標板孔中可能會有少許水樣物質，此為正?，F象，不會對實驗結果造成任何影響。暫時不用的板條應拆卸后放入備用鋁箔袋，按推薦溫度存放！

3.加樣：加樣或加試劑時，第一個孔與最后一個孔的加樣時間間隔如果太大，將會導致不同的“預溫育”時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。每次的加樣時間最好控制在10分鐘內。推薦設置復孔。

4.溫育：為防止樣品蒸發，實驗時必須給酶標板覆膜；洗板后應盡快進行下步操作，避免酶標板處于干燥狀態；嚴格遵守給定的溫育時間和溫度。

5.洗滌：洗滌過程中反應孔中殘留的洗滌液應在吸水紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應孔中吸水。在讀數前要注意清除底部殘留的液體和手指印，以免影響酶標儀讀數。

6.顯色時間的控制：加入底物后請定時觀察反應孔的顏色變化（比如每隔5分鐘），如梯度已很明顯，請提前加入終止液終止反應，避免顏色過深影響酶標儀讀數。

7.底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強光直接照射。

8.混勻：充分輕微混勻對反應結果尤為重要，最好使用微量振蕩器(使用最低頻率)，如無微量振蕩器，可在反應前手工輕輕敲擊酶標板框混勻。

9.安全：試驗中請穿著實驗服并帶乳膠手套做好防護工作。特別是檢測血液或者其他體液樣品時，請按國家生物試驗室安全防護條例執行。