構(gòu)建sgRNA+cas9載體活性鑒定——科研合作/成果轉(zhuǎn)化,行業(yè)標桿!
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更新時間: 2023-07-31T09:56:51
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?構(gòu)建sgRNA+cas9載體活性鑒定
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Surveyor法及測序驗證:
????CRISPR/Cas9打靶基因后引入的突變的方式與ZFN、TALEN基本一致,都是NHEJ或是HR。因此在CRISPR/Cas9的應(yīng)用中,活性檢測或是突變效率的檢測可以參照ZFN和TALEN方法.主要包括有:靶位點直接PCR后TA克隆測序和基于可以識別錯配雙鏈的錯配內(nèi)切酶檢測法(Surveyor法)。
????Surveyor法即錯配酶法:靶序列經(jīng)CAS/sgRNA切割后由于缺乏修復模板,將主要以非同源重組的方式進行修復,或多或少會插入或刪除一些堿基。因此將靶序列PCR擴增后經(jīng)變性、退火,將形成錯配。錯配酶(主要是CEL1或T7E1酶)將識別錯配的雜合雙鏈并剪切。產(chǎn)物跑電泳,比較切割條帶與未切割條帶的比例,即可反映出Cas/sgRNA的活性。
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