?——即高分辨率質譜蛋白質精確分子量的技術服務

?

現代質譜儀在上個世紀九十年代以后，在生物學領域中得到廣泛應用。其中蛋白質多肽類生物大分子的分子量質譜分析也成為現實，主要使用兩種類型質譜：一種是MALDI-TOF直接對分子量進行測量；另一種是使用高分辨率質譜分析電噴霧得到的多電荷信號，然后對信號進行去卷積分析，獲得精確分子量數值。

采用直接MALDI-TOF進行分子量測定的主要問題是，MALDI-TOF質譜儀在不同質量區域內分辨率差別很大，分子量越大，分辨率越低。因此當樣品為大分子蛋白質樣品（比如抗體類藥物）時，MALDI-TOF無法測得精確分子量，更不用說對蛋白質的糖基化等修飾形式進行分析。

“對LC-MS數據進行Deconvolution（去卷積）可以得到蛋白質精確分子量”

?

(1) 抗體類蛋白質藥物的精確分子量測定

抗體類蛋白質藥物是生物醫藥界非常重要的一類樣品，這些蛋白質分子的分子量非常大，一般情況下150KDa左右。因此在沒有高分辨率質譜儀的情況下，要對這類蛋白質進行精確分子量測定是困難的。

在高分辨率質譜儀，特別是orbitrap原理的質譜儀出現以后，抗體類蛋白質的去卷積分子量測定變得容易實現。

下圖中可以看到抗體蛋白質分子在高分辨率質譜上的多電荷信號，通過專用的deconvolution軟件分析，可以得到如下圖中所示的精確分子量數據。圖中顯示的是一個未脫糖的抗體蛋白質的精確分子量圖譜，可清晰分析到不同糖基化形式。

(2) 還原后抗體類樣品的不同亞基精確分子量測定

抗體類蛋白質樣品通過還原，可以將輕鏈和重鏈分開，然后通過HPLC分離，在線進行MS分析得到亞基的精確分子量。

APT為客戶研發如上所述的抗體類蛋白質樣品的亞基還原和精確分子量測定。下圖中可以看到，抗體類蛋白質樣品經過DTT還原后，分離成了輕重兩個亞基，在反相色譜上可以得到有效的分離。只要通過在線的LC-MS分析，即可對亞基進行MS測定，得到精確分子量數據（其中可以看到重鏈中是否糖基化的兩個情況）。

?? ? ? ? ? ? ?

還原后抗體蛋白質分子的精確分子量分析圖譜。左圖為HPLC圖譜；右圖為質譜圖譜。

(3) 小分子量（<25KDa）蛋白質樣品的精確分子量測定

常用蛋白質樣品包括抗體類蛋白質（150 KDa），同時也包括一些相對較小的蛋白質分子。對著這些相對較小的蛋白質，進行LC-MS分析，并去卷積分析得到精確分子量，不需要太高的分辨率即可實現（早期的離子阱，如LTQ就可以實現對小分子量蛋白質的分子量測定）。

APT現在使用Q Exactive質譜進行精確分子量測定，能力上對于這些蛋白質分子更是綽綽有余。

下圖中顯示的是對典型的小分子量蛋白質細胞色素C的精確分子量測定?？梢钥吹劫|譜信號的分辨率在14個電荷時達到50,000以上，每個同位素峰都能夠得到完美分析，分子量測定可以做到subppm級。

技術指標

高分辨率質譜可以對蛋白質樣品（約10-150KDa）進行精確分子量測定，精度達到1Da左右，可以滿足分析蛋白質的修飾狀態（比如糖基化、磷酸化、氧化、C末端K缺失情況等），并可以對這些修飾情況進行定量分析。

APT為客戶進行精確分子量測定的設備為Q Exactive，這是一種高分辨率質譜，采用Orbitrap檢測器，分辨率可任意調整（最高可達140,000 at 200m/z）。一般情況下APT可以為客戶提供在線LC系統對蛋白質分子進行分離后MS分析，因此可滿足對樣品中不同亞基的同時分析。

案例分析

案例一：抗體類藥物樣品的精確分子量測定實例。

APT通過online反相色譜分離后，直接用Q Exactive質譜儀對原始信號進行采集。然后使用ProMass for XcaliburTM對原始數據進行deconvolution計算，得到樣品精確分子量。

從去卷積結果中可以準確讀取抗體蛋白質的分子量信息（同位素分子量，而不是平均分子量）。

圖譜中顯示，該抗體的不同糖基化異構體的分子量信息，可以從這些信息中推測具體的糖基化組成。肽譜中還可以得到不同的糖基化異構體之間的數量比例關系，有助于進行糖型方面的質量控制。

抗體類蛋白質樣品的精確分子量測定圖譜

案例二：小分子蛋白質樣品的精確分子量測定實例。

小分子量蛋白質（<25KDa）的deconvolution算法有所不同，所需要質譜分辨率也可以相應降低。APT為客戶進行此類服務時，也通過在線LC-MS（Q Exactive）采集原始數據，并使用Protein DeconvolutionTM或者ProMass for XcaliburTM進行去卷積分析。由于Q Exactive分辨率遠遠大于小分子解析所需，因此可以非常容易獲得高質量的精確分子量圖譜。

小分子蛋白質樣品的精確分子量測定圖譜（Deconvolution）

“精確測定完整蛋白質分子量，幫助客戶獲得準確和全面的蛋白質序列結構信息。”

Q&A

1) ? ?高分辨率質譜儀是精確測定蛋白質分子量的基石。

完整蛋白質樣品通過LC-MS進行精確分子量測定，需要對得到圖譜進行去卷積分析后獲得實際分子量。蛋白質分子在ESI條件下獲得質譜信號，都是多電荷圖譜，質譜信號的分辨率高低成為是否能進行成功去卷積的關鍵。APT為客戶提供精確分子量測定工作使用的是Q Exactive，最高可以提供140,000（m/z 200）的分辨率，完全滿足各種蛋白質分子量的測定要求。

2) ? ?精確測定完整蛋白質分子量的優點。

通過LC-MS（高分辨率質譜）分析，獲得完整蛋白質的精確分子量，因為其精度高、信息量大和可以與多種前處理方案聯用等等優點，必將受到醫藥工業界的青睞。MALDI-TOF由于分辨率有限，加之其得到的多為單電荷和少電荷的信號，對于大分子量的蛋白質分子，只能得到平均分子量信息。蛋白質分子由于氨基酸序列很長，因此平均分子量和同位素分子量差距較大。而ATP提供的去卷積后精確測定分子量，因為獲得的是多電荷信號，加上Q Exactive能夠提供高分辨率和高精度信號，因此經過解析后得到精確分子量和理論分子量之間誤差在數個ppm（對于抗體類蛋白質分子，誤差僅1Da左右）。