?土壤非靶標代謝組學（Untargeted metabolomics）檢測分析方案

一、項目簡介

1.1 土壤代謝組學概述

土壤代謝組學（soilomics）是指用代謝組學的方法研究土壤中有機質及土壤微生物代謝含量變化及相互作用的一門科學。土壤微生物是土壤不可缺少的組成部分，是陸地生態系統中的分解者和調節者，能夠參與生態系統的物質循環以及能量流動，其分布及活性揭示土壤的變化規律和演變趨勢。研究土壤微生物碳代謝功能特征可以了解微生物多樣性及其碳代謝能力，為探索調節、控制和改善土壤環境質量提供重要的參考。?

表1. 土壤碳源主要化合物

1.2 技術路線

圖1. 土壤代謝組學技術路線圖

1.3實驗設計
土壤樣品，分A, B, C, D四組，每組6個平行樣品，共計24例，進行GC-TOF-MS平臺的土壤非靶標代謝組學檢測，并對得到的數據進行進一步生物信息學分析。
樣品詳情：共計24例樣品。

1.4分析內容
針對非靶標代謝組學數據分別進行如下對比，并對得到數據進行進一步的生物信息學分析：
進行A組 vs D組，B組 vs D組，C組 vs D組共計3次對比分析。
基礎數據分析包括：數據預處理，主成分分析（PCA），正交矯正偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）,差異化合物篩選。
1.5檢測平臺
檢測分析平臺：GC-TOF-MS

二、檢測分析方案
2.1數據預處理
對原始數據進行解卷積，峰對齊，標準化分析，通過原始總離子流(TIC)色譜圖，初步觀察儀器的保留時間重現性，所測得的物質數量，以及不同組之間的色譜圖是否具有較明顯的差異。

圖2. 所有GC-TOF-MS樣本重疊總離子流（TIC）色譜圖

2.2 PCA分析
對樣本進行主成分分析能從總體上反應各組樣本之間的總體代謝差異和組內樣本之間的變異度大小。使用SIMCA軟件(V14.1, Umetrics, Umea, Sweden)對數據進行UV格式化（Unit Variance Scaling）和平均中心化（Mean-Centered）處理[1]，以獲得更加可靠且更加直觀的結果。軟件進行自動化模型擬合分析，獲得最可靠數學模型的主成分數目。例圖如下所示：

圖3. PCA模式識別得分圖
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[1]?Scaling base weight types available：

2.3正交偏最小二乘方-判別分析（OPLS-DA）
為了消除與分類不相關的噪音信息，同時也為了獲得導致兩組之間顯著差異的相關代謝物信息，我們采用正交偏最小二乘方判別分析（OPLS-DA）過濾與模型分類不相關信號即正交信號，獲得OPLS-DA模型。對模型的質量用交叉驗證法進行檢驗，并用交叉驗證后得到的R2X 和Q2(分別代表模型可解釋的變量和模型的可預測度)對模型有效性進行評判。在此之后，通過排列實驗對模型有效性做進一步的檢驗。
例圖如下所示：
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[2] 載荷圖（loading plot）的橫坐標代表每個物質在第一主成分上的載荷大?。╟osα），縱坐標代表每個物質在第二主成分上的載荷大?。╟osβ）。

[3] 置換檢驗的橫坐標代表隨機分組的Y與原始分組Y的相關性，縱坐標代表R2和Q2的得分。
[4] ROC作為模型的一種外部檢驗，當AUC越靠近1時表示模型越可靠。

[5] S-plot的橫坐標代表每個物質在第一主成分上的載荷大?。╟osα），縱坐標代表每個物質和第一主成分相關系數（可靠性）的大小。
[6] S-line的橫坐標代表每個物質的ID，縱坐標代表每個物質在第一主成分上的載荷大?。╟osα）,顏色代表縱坐標代表每個物質和第一主成分相關系數（可靠性）的大小。
2.4代謝物定性及差異化合物篩選
代謝物定性的方法為：搜索Biotreelib GC-MS標準物質數據庫和NIST商業數據庫（自動峰識別和保真解卷積?）。
我們采用 OPLS-DA模型第一主成分的VIP（Variable Importance in the Projection）值（閾值>1），并結合學生氏t檢驗(t-test)的p值（閾值≤0.05）來尋找差異性表達代謝物。

三、時間概算
實驗檢測：45個工作日（從收到客戶預付款并收到樣品之日起）
數據分析：10個工作日
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