大鼠骨髓間充質干細胞原代培養

實驗動物

SD大鼠，2周齡，若干

實驗步驟

1.無菌操作注意事項

細胞培養一定要保持工作區的無菌清潔，先用紫外燈和臭氧殺菌1h，然后通風30min，操作前需要換細胞間專用拖鞋，雙手帶上一次性橡膠手套并用75%乙醇消毒，穿上實驗服，戴上一次性口罩和帽子，操作時不能大聲說話，整個無菌操作都應該在酒精燈的周圍進行。

2.細胞生長培養基的制備

培養基在使用前需加入10%的胎牛血清和雙抗，一般為血清。培養基分裝成小瓶(100～200 mL)以便使用，翻帽塞塞緊瓶口。 按細胞生長需求，制備相應的生長培養基。一般的細胞生長培養基為培養基+10%胎牛血清，最后按1％體積分數加入雙抗貯存液(青霉素+鏈霉素)，使青霉素和鏈霉素的終濃度分別為100 U／mL和100 U／mL。

3.大鼠骨髓間充質干細胞的分離

（1）取SD大鼠，頸椎脫臼法處死后立即用75%乙醇浸泡，移入超凈工作臺內，用大頭針固定大鼠四肢于工作臺面的泡沫板上。

（2）碘酒擦拭四肢，再用酒精棉球擦拭，無菌條件下用滅菌消毒后的鑷子和剪刀分離出大鼠股骨和脛骨，剔除骨頭表面肌肉，PBS溶液沖洗兩遍。

（3）從中間剪斷股骨和脛骨，用2ml無菌注射器吸取DMEM/F12溶液沖出骨髓細胞多次，再用針頭吹打，吸管吸入離心管內，1000r/min離心5min，棄上清，用PBS重懸細胞。

（4）緩慢將細胞懸液加入預先裝有5mL淋巴細胞分離液的15mL離心管內，保持細胞懸液在淋巴細胞分離液上層，注意不要攪動液面，保持二者分層界面。

（5）2000rpm離心15-25min，離心后溶液分4層，吸取中間骨髓基質細胞層（白色渾濁狀），PBS洗三次。

（6）用含15%胎牛血清及青鏈霉素的DMEM/F12以106/mL的細胞濃度接種于25cm2培養瓶中，置37℃、5%CO2恒溫培養箱中培養。

（7）24小時后棄去培養液（看細胞貼壁情況），PBS沖洗 2-3次去除未貼壁細胞，加入培養液繼續培養。以后每3d半量換液1次，一般10d細胞生長融合。

（8）經0.25%胰酶消化，1：2傳代（接種密度1*105/cm2），其后一般3-5d傳代1次，選取生長良好的第三代細胞進行后續實驗。

細胞形態

骨髓間充質細胞原代培養過程中，約24小時即可出現貼壁生長，細胞呈圓形、梭形、三角形生長緩慢。換液后細胞增殖明顯，出現以梭形為主的多種形態，10-14天70%-80%可融合達到傳代標準。傳代細胞形態單一，呈梭形或扁平型，增殖至細胞融合時呈漩渦狀和放射狀排列。

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