基于CRISPR/cas9的基因功能缺失文庫篩選

CRISPR/cas9基本原理

Int. J. Mol. Sci. 2015, 16(11), 26077-26086.

? ? ??Cas9是一種核酸酶，在sgRNA引導下Cas9定點切斷DNA，造成雙鏈斷裂，雙鏈斷裂的部位通過非同源末端接合（NHEJ）修復，往往會造成幾個堿基的插入或刪除，形成移碼突變。而雙鏈斷裂的部位通過同源重組則可以定向插入感興趣的基因。

基于CRISPR/cas9的基因功能缺失文庫篩選(in vitro)

? ? ??Step1：尋找靶點，設計sgRNA文庫(GeCKO文庫)；

? ? ? Step2：合成oligo，構建載體，病毒包裝文庫；

? ? ??Step3：文庫病毒感染目的細胞，篩選，深度測序。

? ? ? [注]GeCKO:genome-scale CRISPR-Cas9 knockout

有助于細胞耐藥的sgRNA將在14天的細胞中富集

? ? ??1.Cas9-EGFP慢病毒感染NSCLC細胞，并篩選表達cas9-EGFP的陽性細胞；

? ? ? 2.sgRNA文庫病毒感染Cas9-EGFP陽性細胞；

? ? ? 3.篩選成功感染的細胞；

? ? ??4.將細胞移植裸鼠成瘤；

? ? ? 5.深度測序，分析晚期腫瘤和轉移灶中sgRNA富集情況。

技術流程

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基因功能缺失文庫的應用

耐藥機制研究

? ? ??張峰實驗室2013年在SCIENCE發表的文章Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening?in Human Cells中報道，他們利用CRISPR-Cas9文庫對人類黑色素瘤A375細胞中的18,080個基因進行篩選，最終發現基因NF2、CUL3、TADA2B、TADA1參與了黑色素瘤A375細胞抵抗維羅非尼(vemurafenib)的耐藥過程。

腫瘤發生發展機制研究

? ? ??張峰實驗室2015年在CELL雜志上報道，他們利用CRISPR-Cas9技術對腫瘤的生長和轉移進行全基因組功能缺失篩選。利用帶有67,405個sgRNA的基因組規模文庫，構建突變細胞系并移植裸鼠，分析晚期腫瘤和轉移灶細胞的基因表達情況，發現NF2、PTEN、CDKN2A、TRIM72、FGA、miR-345及miR-152基因能夠促進非小細胞肺癌細胞侵襲，且這些基因與原發性腫瘤的生長和侵襲成正相關。

基因調控機制研究

? ? ??CRISPR-Cas9文庫篩選技術不僅可以用于編輯人類細胞蛋白編碼基因，對于基因組中的調控元件也同樣有效，利用這種方法可以對基因環路上游調控機制進行分析。Nature biotechnology發表文章，科研人員利用CRISPR-Cas9文庫對癌癥細胞中關鍵的轉錄因子p53和ERα的增強子元件的685個基因位點進行篩查。通過CRISPR-Cas9文庫篩選，共鑒定出3個增強元件與ERα的相關;3個增強元件與p53功能相關聯，其中2個增強元件與p53完全結合才能激活細胞衰老過程。

? ? ??Korkmaz, G., et al., Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using CRISPR-Cas9. Nat Biotechnol, 2016. 34(2): p. 192-8.

非編碼RNA作用機制研究

? ? ??CRISPR-Cas9文庫的建立可以實現基因組的大規模篩選，為了對非編碼基因的功能進行驗證，Naturebiotechnology發表文章，提出構建了psgRNAs文庫的方法，這種成對的sgRNA可在同一基因中造成兩處斷裂，形成大片段缺失，從而影響表型變化，成為研究非編碼基因的重要方法。使用慢病毒psgRNA文庫，對人源肝癌細胞系Huh7.50C進行基因組的700個IncRNA和另外5種癌癥細胞進行敲除實驗，最終篩選到51個IncRNA基因能夠促進或者抑制腫瘤的生長。

? ? ? Zhu, S., et al., Genome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR-Cas9 library. Nat Biotechnol, 2016.34(12): 1279-1286.