產品介紹：

2-（4-羥基苯偶氮）苯甲酸(2-(4-Hydroxyphenylazo)benzoic acid ,英文縮寫HABA)可以與親和素特異性結合，其結合復合物為一種黃色或者橘黃色，在500nm有最大吸光值；但是其結合力遠遠低于生物素與親和素的結合，當溶液中存在生物素的時候，生物素會強競爭讓HABA解離下來,引起吸光值下降?；诖嗽?，可以根據500nm吸光值的變化計算出蛋白標記生物素的量（被標記蛋白與生物素的摩爾比）。

生物素標記摩爾比的計算是基于比爾-朗伯定律（Beer–Lambert law），又稱比爾定律或比耳定律（Beer's law），是分光光度法的基本定律，即當一束平行單色光垂直通過某一均勻非散射的吸光物質時，其吸光度（Absorbance，A）與吸光物質的濃度（Consenreation，C）及吸收層厚度（length，L）成正比, 用公式表示為：A = ε*C* L其中A為光度，ε為摩爾吸光系數,所以此處公式為A 500= ε500 C L（此處ε500=34,000M-1cm-1）

主要組分：

儲存條件：

該試劑盒在低溫下運輸，收到后請置于2-8℃保存，保存時間2年以上。

實驗操作可以選擇分光光度法或微孔酶標板法：

分光光度法：

A． 取900uL HABA- Avidin混合液放入1cm光程比色杯，在500nm波長測量吸光值，記錄為A_500(H-A);最好測量三次取平均值；

B． 在比色杯中加入100uL待測的生物素標記蛋白（Biotinylated Protein,簡稱BP），充分混勻后，在500nm波長測量吸光值，吸光值穩定20秒以上，記錄為A_500(H-A-BP);最好測量三次取平均值；如果A_500(H-A-BP)<0.35,請用PBS稀釋待測樣品，再次重復此步驟。

微孔酶標板法：

A. 取180uL HABA- Avidin混合液放入微孔板中，在500nm波長測量吸光值，記錄為A_500(H-A);最好測量三次取平均值；

B. 在微孔板中加入20uL待測的生物素標記蛋白（Biotinylated Protein,簡稱BP），震蕩或移液器吹打充分混勻后，在500nm波長測量吸光值，吸光值穩定20秒以上，記錄為A_500(H-A-BP);最好測量三次取平均值；如果A_500(H-A-BP)< 0.3*A_500(H-A),請用PBS稀釋待測樣品，再次重復此步驟。

案例演示：

以Frdbio超級生物標記試劑盒（貨號：ARL0021SK）標記Anti-Covid-19 Spike Mab (貨號：nCoV-S-hMab-B)，標記后測算標記比，分光光度計法。

本案例中被標記蛋白為抗體，分子量（MW）為150,000,濃度為5.0mg/mL，A_500(H-A)=1.090，A_500(H-A-BP)=0.585，

抗體摩爾濃度計算：mM /mL=5/150000=3.33*10^-5

ΔA₅₀₀=（0.9*1.090）- 0.585=0.396

生物素摩爾濃度計算：mM /mL=0.396/(34000*1)=1.16*10^-5

抗體：生物素（摩爾比）=(3.33*10^-5)/(1.16*10^-5*10)=1:3.48