一、產品介紹

干細胞凍存保護液（hESC/ iPSC Cryopreservat ionSolution），是即行即用，無需程序降溫，且無動物成分、無血清,化學成分明確，可在穩定細胞表型和生長狀態和保持細胞多能性的同時提供最佳的細胞回收效率。

hESC/iPSC 細胞培養基試劑盒是廈門逸漠生物科技有限公司研發技術團隊開發的一種適用于無飼養層培養，成分明確，補充多種生長因子的人多能干細胞（hPSC）無血清培養體系。hESC/iPSC 在 hESC/iPSC 細胞培養基中可以快速增殖，而邊緣分化的細胞則在該培養基中生長較慢，從而選擇性擴增并獲得高純度人多能干細胞。

hESC/iPSC細胞培養試劑盒說明書下載

二、產品信息

表 1： hESC/iPSC 完全培養基 試劑盒產品內容

表 2： hESC/iPSC 其他相關試劑 產品內容

三、試劑材料

表 2：其他試劑&材料

四、 試劑準備

1 ）hESC/iPSC 完全培養基配制（500 mL ）

1. 在 4℃條件下解凍 hESC/iPSC Grouth SupplementsA/B，勿在 37℃培養箱/水浴鍋解凍。

2. 參考表 表 3 在生物安全柜中，使用無菌移液管混勻下列成分配制成 hESC/iPSC 完全培養基，之后置于 4℃儲存，封口膜封好后 2 周內使用。

3. 有初培養需擴建的需求，建議先配置 100 mL,保證 2 周內使用完畢。

表 3：hESC/iPSC 完全培養基配置說明*

可根據實際用量將 hESC/iPSC Grouth Supplements A/B 分裝后冷凍保存。具體配置比例可參考表 3 的配置說明。hESC/iPSC Grouth Supplements A/B 凍融總次數不能超過 2 次。

2 ）Matrigel 鋪板（以貨號為 354277 的 的 Corning? Matrigel? 包被 6 孔板為例 ）

A. 裝 分裝 Matrigel

1. 貨號 354277 的 Matrigel，操作說明中不標注蛋白濃度，而是以 Dilution Factor 表示，如某批次的推薦 Dilution Factor 為 278 μL，則表明 278 μL 可包被 4 塊 6 孔板，分裝數量=5 mL/0.278=17.98。

2. 準備 18 個無菌 1.5 mL EP 管，標記 Matrigel 日期、操作人；1mL 無菌吸頭；EP 管架，均置于-20℃冰箱中預冷 1 小時。

3. 將 Matrigel 放置 4℃冰箱過夜解凍，當 Matrigel 完全解凍即可開始分裝。

注：在解凍時，將 Matrigel 放置冰箱內側角落，切勿放在靠近冰箱門附近。

4. 準備一個裝滿碎冰的冰盒，將解凍過的 Matrigel、預冷的 1.5 mL EP 管及 EP 管架、1mL吸頭放置于生物安全柜上。

5. 混勻 Matrigel，無菌分裝于各個 1.5 mL EP 管中，并置于冰上。當吸頭被堵塞可能導致分裝體積不準時需要更換吸頭。

6. 將分裝后的 Matrigel 置于-20℃冰箱中保存。

B. 鋪板

1. 取 36 mL 冷藏 DMEM/F12 于 50 mL 離心管中，準備 4 個 6 孔板，標記 Matrigel、批號、日期和操作人。

2. 1 mL 無菌吸頭置于-20℃冰箱中預冷 1 小時，取出一支冷凍的 Matrigel（5mL）置于 4℃冰箱解凍至完全化凍。

3. 準備一個裝滿碎冰的冰盒，將解凍過的 Matrigel、預冷的 1mL 吸頭放置于生物安全柜上。

4. 用預冷的吸頭向解凍過的 Matrigel（5mL），加入 1 mL 冷的 DMEM/F12 反復吹打解凍并混勻。

5. 吸出已解凍混勻的 Matrigel 加入離心管中剩余的 DMEM/F12，使用 10 mL 移液管再次反復吹打混勻。

6. 分裝 1.5 mL/孔于 4 個六孔板中，輕輕搖晃混勻。

7. 培養板置于室溫 1 小時后即可使用，或置于 4℃冷藏過夜，兩周內使用。

五 、 復蘇 hESC/iPSC （以 6 孔板為例）

1. 將水浴鍋預熱至 37℃。

2. 將 Matrigel 包被的 6 孔板，提前放置生物安全柜中約 1 小時恢復至室溫（15~30℃）。

3. 取 4 mL hESC/iPSC 完全培養基，按照 1:4000 比例加入 1 μL 的 hESC/iPSC Supplement C，恢復至室溫（15~30℃）。

TIPS：不要在 37℃水浴鍋中預溫培養基。

4. 取出 1 支冷凍的細胞置于 37℃水浴鍋手持輕輕搖晃，2 min 內解凍，肉眼觀察細胞懸液內冰晶即將完全消失時取出。

5. 75%酒精無塵紙擦拭凍存管表面，轉入生物安全柜；將細胞懸液移到事先準備好的 15 mL離心管中，隨后逐滴加入 10mL DMEM/F12，過程中輕柔晃動混勻細胞，160 g 離心 5 min。

6. 吸棄上清，加入預溫的 4 mL 的 hESC/iPSC 完全培養基混勻細胞，盡量避免吹打。

注：可留 20 μL 上清液，輕彈管底，使細胞懸浮液更均勻，避免成較大細胞團。

7. 吸除 6 孔板中 2 孔的 Matrigel 包被液，將混勻的細胞按照 2 mL/孔接種到 2 孔中。

8. 水平十字搖勻三次，置于 37℃，5% CO 2 濃度，飽和濕度的培養箱中，再次水平十字搖勻三次培養。

9. 18-24 小時后換新的 hESC/iPSC 完全培養基，之后每天更換培養基。

注：在 hESC 培養過程中，如果細胞的匯合度超過 50%，建議更換培養基時，培養基的體積增加至 3-4mL/孔。

表 4： hESC/iPSC 傳代&培養操作試劑推薦用量

六 、傳代 hESC/iPSC （以 6 孔板為例）

1. 傳代條件：① 細胞匯合度達 85%左右（如圖 1(C-D)所示），一般情況下每 3-4 天傳代；

② 細胞匯合度較低，生長密度分布不均勻。

注：即使克隆團較小、匯合度不足，也建議不要連續培養超過 5 天。

2. 傳代比例：可根據細胞生長狀態和實驗需要按 1:5~1:12 的比例進行傳代，如果細胞正常，克隆團匯合度 85%，大小均勻（如圖 1(C-D)所示），建議按照 1:8 進行傳代，如果密度偏低，則可降低傳代比例；密度偏高，則增加傳代比例。

注：1:8 傳代就是 1 個孔瓶傳 8 個孔（以 6 孔板為例）。

3. 將 Matrigel 包被的 6 孔板，提前放置生物安全柜中約 1 小時恢復至室溫（~25℃）。

4. 根據傳代接種的孔數準備 2 mL/孔的 hESC/iPSC 完全培養基，并按 1：4000 比例加入hESC/iPSC Supplement C( IMC-014-Y） ，恢復至室溫（~25℃）。

圖 1.hESC/iPSC 完全培養基連續培養 hESC 細胞形態圖 ：（A ）和（C ） 分別為 hESC 細胞培養第 2 和 4

天時 低倍鏡 hESC 培養 形態圖示， （B ）和（D ） 為培養至第 2 和 和 4 天時的 高倍鏡 hESC 培養 形態圖。

5. 將 Matrigel 包被的 6 孔板，提前放置生物安全柜中約 1 小時恢復至室溫（~25℃）。

6. 根據傳代接種的孔數準備 2 mL/孔的 hESC/iPSC 完全培養基，并按 1：4000 比例加入hESC/iPSC Supplement C，恢復至室溫（~25℃）。

7. 將孔內培養基吸取，加入 2 mL/孔的 DPBS（不含鈣鎂），輕輕搖晃并吸取。

8. 加入 2 mL/孔的 hESC/iPSC Passage Solution 使溶液完全覆蓋孔底。

9. 置于 37℃培養箱中孵育 8-9 min。

注：① 消化 8-9 min 后鏡下觀察細胞變化，當大部分細胞變亮變圓，且細胞尚未脫離基質或漂起時即可終止消化，若大部分細胞仍未變亮，則需要延長消化時間；

② 保持 6 孔板與培養箱金屬隔板直接接觸，使 6 孔板受熱均勻，不要疊放。10. 消化結束后輕輕地將細胞培養板拿回生物安全柜，避免震蕩搖晃細胞，傾斜并吸除hESC/iPSC Passage Solution。

11. 及時加入 2 mL/孔預溫的 hESC/iPSC 完全培養基+ hESC/iPSC Supplement C，水平十字搖晃 6 孔板使細胞脫離基質。

注：① 加 hESC/iPSC 完全培養基+ hESC/iPSC Supplement C 時，可輕柔吹打細胞 1-2 次，不能超過 2 次，避免反復吹打；有部分細胞（10%～15%）未脫離基質是正?，F象，若有大量細胞未脫離則需延長消化時間（< 10min）。

② hESC 不能長時間處于 hESC/iPSC Passage Solution（<15 min），所以收集接種細胞時操作必須快速,以及最好一次操作不要超過 4 孔（六孔板）。

圖 2 ： 消化 hESC 細胞不同時間 形態圖 ： （A ） 消化 8 min 低倍鏡 hESC 培養的 的形態圖; （B ） 消化 9 min

低倍鏡 hESC 培養的 的形態圖。

12. 吸取 6 孔板中的 Matrigel 溶液，加入預溫的 hESC/iPSC 完全培養基+ hESC/iPSC Supplement C 2 mL/孔。

13. 在 6 孔板上標記細胞名稱、代次、傳代比例、日期、操作人。將步驟 9 獲得的細胞懸液輕輕搖勻，按預先設定的傳代比例均勻分配于孔板中。

注：為了鋪板均勻并降低對細胞的損傷，可以將步驟 9 獲得的細胞懸液收集至 2 mL 離心管，輕柔顛倒混勻細胞 1-2 次；再按照傳代比例接種。

14. 接種后，水平十字搖勻 6 孔板三次，置于 37℃，5% CO 2 濃度，飽和濕度的培養箱中， 再次水平十字搖勻 6 孔板三次，培養過夜。

15. 18-24 小時后更換新 hESC/iPSC 完全培養基，此后每天換液，4-5 天后繼續傳代/凍存。

七、凍存 hESC/iPSC

1. 當細胞匯合度達 85%左右（如圖 1(C-D)所示）可收獲凍存，一般 6 孔板每孔可凍存 1 管。

2. 準備相應數量的 1.5/2 mL 凍存管，標記細胞名稱、代次（P#）、日期、操作人。

3. 取出 4℃冰箱中的 hESC/iPSC Cryopreservation Solution，置于室溫預溫，使用前注意 搖勻。

4. 吸取上清液，加入 2 mL/孔的 DPBS（不含鈣鎂），輕輕搖晃數次，再吸取。

5. 加入 2 mL/孔的 hESC/iPSC Passage Solution，將細胞置于 37℃培養箱中，計時 8-9 min（可

參考“ 六、傳代 hESC/iPSC”步驟）。

6. 消化結束，輕輕取出培養板，吸取 hESC/iPSC Passage Solution。

7. 搖勻預溫的 hESC/iPSC Cryopreservation Solution，每孔加入 1 mL 凍存液，輕柔吹打，水平十字搖勻 3 次，隨后吸取細胞懸液加入 1.5/2 mL 凍存管中。

8. 將細胞置于梯度程序降溫盒中，并置-80℃冰箱中過夜，次日轉入液氮罐中長期保存。

八、其他培養體系中 hESC/iPSC 更換為 hESC/iPSC 完全培養基條件的適應

其他無飼養層條件培養的 hESC/iPSC 可以在細胞狀態良好時，使用原培養基進行細胞傳代，24 小時后更換成混合培養基（原培養基與 hESC/iPSC 完全培養基按照 1:1 混合）培養，培養 2 代后完全換成 hESC/iPSC 完全培養基培養，培養 2-3 代后可完全適應新的培養體系，此時可進行細胞凍存處理。