?——即蛋白質藥物氨基酸序列覆蓋率技術服務

蛋白質多肽類藥物往往擁有很長的氨基酸序列，在傳統蛋白質化學領域，對這些分子進行序列分析需要進行諸如Edman降解法等的化學分析。但是，對于大多數蛋白質藥物樣品而言，化學測序方法都不能完成對整個氨基酸序列的覆蓋（Edman降解法的測序極限，根據文獻是70個氨基酸左右，APT為客戶完成過50個氨基酸測序工作）。然而蛋白質類藥物的理化性質分析中需要氨基酸序列的覆蓋率信息，用以完善蛋白質類藥物的理化性質信息。APT為客戶提供基于shotgun方法的蛋白質多肽類藥物的氨基酸序列覆蓋率測定服務。

上圖為shotgun方法的nano-spray離子源，可以用來使酶解后多肽分子電離，被質譜儀所分析。

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“蛋白質類藥物的覆蓋率測定從方法學上類似于蛋白質組學的shotgun法”

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技術指標

質譜方法對蛋白質多肽藥物分子的肽段覆蓋率進行分析的基本原理是將蛋白質分子選用特異性蛋白酶進行切割，酶解后的供試品為復雜的肽段組成的混合物，然后經過液相聯用質譜儀進行檢測。APT為提高質譜儀對肽段覆蓋率的檢測，采用Trypsin、Chymotrypsin、GluC三種酶切以提高覆蓋率。

APT采用LTQ-Velos質譜儀（Thermo Finnigan, San Jose, CA）進行質譜分析。進樣方式：Microspray；毛細管溫度：200℃；檢測方式：正離子；多肽和多肽碎片的質量電荷比按下列方法采集：每次全掃描（full scan）后采集20個碎片圖譜（MS2 scan）。

LTQ-Velos產生的原始數據由Bioworks 3.3軟件查庫，搜索使用數據庫為根據樣品理論序列建立的蛋白庫，數據篩選參數為：Xcorr ≥ 1.9（Charge 1），Xcorr ≥ 2.2（Charge 2）和Xcorr ≥ 3.75（Charge 3）。APT采用標準是二級質譜覆蓋到的肽段覆蓋率。

“多種蛋白質內切酶聯合酶解，有利于提高氨基酸序列的覆蓋率?！?/span>

“對于抗體樣品的覆蓋率實驗，脫糖后分析有利于提高覆蓋率?！?/span>

案例分析

由質譜結果（下圖）可以看出三種酶酶切均較為充分。查庫結果進行整合之后，最終得到該供試品輕、重鏈各自的覆蓋率。

本供試品（下圖）輕鏈氨基酸序列共有XXX個殘基，匹配到的氨基酸殘基序列共計XXX個殘基，匹配到的序列占總序列的XX%。

供試品輕鏈的覆蓋率（紅色部分）

本供試品（下圖）重鏈氨基酸序列共有XXX個殘基，匹配到的氨基酸殘基序列共計XXX個殘基，匹配到的序列占總序列的XX%。

供試品重鏈的覆蓋率（紅色部分）

Q&A

1)????蛋白質類藥物的多種內切酶的酶解。

大多數酶解試驗中，常用的蛋白質內切酶有胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、Arg-C酶、Lys-C酶和Glu-C酶等等。不同蛋白質內切酶作用于不同的氨基酸殘基末端，形成不同長度的多肽分子。因此對于肽段覆蓋率的檢測一般會采用多種酶解聯合使用的策略，以提高質譜儀對肽段覆蓋率的檢測。

2)????是否使用高分辨率質譜進行蛋白質的覆蓋率分析？

質譜儀發展已經到了“雙高”的程度（高分辨率/高精度），超過10萬分辨率的質譜儀大量涌現，分析精度更是小于1ppm。這些高端質譜儀對樣品分析的準確度都大為提高，假陽性率大大降低。APT使用的高分辨率質譜儀Q Exactive（Thermo Scientific）將高性能四級桿的母離子選擇性與高分辨的準確質量數（HR/AM）Orbitrap檢測技術相結合，提供優異性能和出色多功能性。其分辨率高達140,000，最大掃描速率12Hz，掃描間動態范圍 >5000:1，S-Lens離子源，提供更佳靈敏度。采用高分辨質譜儀進行蛋白質的覆蓋率分析可大大提高檢測的準確性。