產品簡介 

S-27 supplement, serum free, 50X是一種最常被引用的神經細胞培養添加劑，是一種優化的無血清添加劑，用于支持胚胎、出生后和成年海馬神經元和其他中樞神經系統（CNS）神經元的生長和活性維持。S-27無血清添加劑以50倍工作液提供，可以與基礎培養基(Neuronal)培養基組合使用，用于神經細胞培養而無需再添加飼養層細胞。在神經元基礎培養基中使用S-27 supplement, serum free, 50X添加劑，用于培養產前和胚胎神經元，以獲得優化的活性和長期的存活率。

本產品可以代替B-27添加劑。

儲存條件

-25~-15℃避光保存，有效期2年。

使用說明

S-27 supplement, serum free, 50X細胞培養添加劑是50×濃度。使用前請用基礎培養基(如Neurobasal)稀釋到1×。如準備50 mL培養基：將1 mL的S-27細胞培養添加劑(50×)加入到49 mL的基礎培養基中。配置好的培養基，可于2~8℃避光保存1周。

1、培養基制備

（1）置于4°C解凍本產品。

（2）在使用前無菌添加2%本產品和0.5 mM L-谷氨酰胺至神經元基礎培養基，配置成神經元完全培養基（注：下文中出現的“神經元完全培養基”即指此種添加了S-27添加劑和L-谷氨酰胺的神經元基礎培養基）。注意：剩余的本產品可以等分成工作體積，并儲存在-25~-20℃。在以后的試驗中根據需要解凍相應體積的本產品。避免反復凍融。

（3）對于原代海馬神經元培養，神經元完全培養基（由前述步驟制備）需要額外補充25 μM的L-谷氨酸，在培養的第4天以后的換液中應不再添加谷氨酸。配置好的完全培養基，可于2~8℃的避光保存1周。

2. 細胞培養步驟

下列步驟已在大鼠胎兒原代海馬和皮層神經元，以及神經母細胞瘤細胞系中測試。

（1）用無菌的冷的0.05 mg/mL多聚賴氨酸水溶液包被培養表面(玻璃或細胞培養級塑料)，每平方厘米表面使用0.15 mL，在室溫下保溫1 h。

（2）去除多聚賴氨酸溶液，并用無菌蒸餾水沖洗兩次(須徹底清洗，因為多聚賴氨酸對細胞有毒性)。在超凈工作臺中打開培養板的蓋子通風，直到每個孔都完全干燥。培養板干燥后可以立即使用或在4°C最多保存2周。

（3）根據標準實驗室程序或隨細胞提供的說明書分離原代的大鼠神經元或解凍凍存的原代大鼠神經元。

（4）在預熱的(37°C)神經元完全培養基中（如前所述的方法制備)接種細胞，建議的細胞密度為160個細胞/mm²，或必要時使用自行優化的細胞密度。注意：對于海馬神經元，培養基中須添加25 μM L-谷氨酸，參見“完全培養基的制備”。

（5）在36~38°C，含5%二氧化碳的潮濕環境中培養（使用自然空氣也是可接受的，但推薦含9%氧氣和5%二氧化碳的氣體環境）。

（6）培養4~24h后，更換一半體積的新鮮培養基，繼續在培養箱中培養。

（7）對海馬神經元以外的細胞：在接種4天后，更換一半體積的新鮮的完全培養基，之后每三天重復一次。對海馬神經元：接種三天后，用不含L-谷氨酸的新鮮培養基更換一半體積的培養基，之后每三天重復一次。注意：在完全培養基中添加25µM 2-巰基乙醇，可改善海馬神經元的長期存活率。

3. 分離原代大鼠胚胎神經元

下列程序推薦用于培養受精18天的大鼠胚胎海馬神經元和大腦皮層神經元。

（1）從受精18天的大鼠胚胎中分離大腦皮層和雙側海馬。

（2）在預置了完全培養基的錐形管中收集所有的組織。放置，直到所有的組織都已解體。

（3）使組織沉積在管的底部，然后小心地去除上清液，只留下剛好可覆蓋組織的最少量的培養基。

（4） 在不含鈣離子的培養基中，使用2mg/mL過濾滅菌的木瓜蛋白酶溶液，在30°C酶解組織大約30min，其間每5min輕搖錐形管以幫助降解。每對海馬組織使用2mL酶溶液。

（5）加入兩倍體積的完全培養基以恢復二價陽離子的濃度，停止酶解。

（6）使未解離的組織沉降至管底（約2min），然后把上清液轉移到15mL離心管中，以150g離心5 min。

（7）在1mL神經元完全培養基中重懸沉淀物，取一小份(例如10μL)進行細胞計數。后續的操作按照“復蘇和培養凍存的神經元”的第8-10步驟進行。

4. 復蘇和培養凍存的神經元

重要提示：原代神經元細胞將會貼附在裸露的塑料或玻璃表面，建議事先用神經元完全培養基沖洗所有的塑料和玻璃器皿的內表面，以獲得最高的回收率和產量。由于細胞從凍存狀態復蘇時極其脆弱，請在整個操作過程中不要震蕩或離心細胞。我們建議每次只解凍一管細胞。務必減少從液氮中轉移凍存管到37°C水浴中的操作時間。細胞從液氮罐到水浴的運輸過程中，可在冰桶中放少量液氮，將細胞置于這個冰桶中來進行。

（1）在解凍細胞之前，用神經元完全培養基沖洗無菌的15mL錐形管，然后在超凈工作臺中通風晾干。

（2）從液氮中取出凍存管時可稍微擰松管帽以釋放壓力，然后再擰緊。

（3） 在37°C水浴中輕柔攪拌凍存管以快速解凍細胞（小于2min）。當觀察到凍存管中只有很少量的冰晶存在時（觸摸凍存管仍然感覺是冷的）從水浴中取出。

（4）在超凈工作臺中用70%的異丙醇消毒凍存管。在工作臺臺面上輕敲凍存管以使管內液體沉降到管底。

（5） 使用事先用神經元完全培養基沖洗并干燥過的1mL吸頭極其輕柔地將細胞轉移到事先沖洗并干燥的15 mL錐形管中。

（6）用1 mL預熱的神經元完全培養基沖洗沖洗凍存管，以每秒一滴的速度極其緩慢地加入到15 mL錐形管中的細胞里。每加一滴都輕柔地轉動錐形管一次。不要一次即把全部培養基加到錐形管中。

（7）慢慢地逐滴加入另外2mL預熱的完全培養基，使管內的液體體積為4mL。用1 mL吸頭輕柔地混合液體，注意不要造成任何氣泡。

（8）用一個事先沖洗干燥過的吸頭吸取10μL細胞懸液加入到含有10μL 0.4%臺盼藍的微量離心管中，輕敲管壁以混勻溶液。使用手動的細胞計數方法測定活細胞密度。解凍的細胞的活率應超過50%。

（9）在已經事先用多聚賴氨酸包被（參見“細胞培養步驟”）的48孔板中每孔中接種大約1×10⁵個細胞或按所需的細胞密度接種。加入預熱的神經元完全培養基將細胞懸液稀釋到每孔500 μL。

（10）按照“細胞培養步驟”中的5-6步驟進行神經元的培養。在36~38°C，含5%二氧化碳的潮濕環境中培養（使用自然空氣也是可接受的，但推薦含9%氧氣和5%二氧化碳的氣體環境）。

注意事項

1.為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

2. 避免反復凍融，應及時分裝，最好在４℃下過夜融化，稀釋時要求在無菌環境中進行。