原位雜交技術服務

◆ 概述
??? 原位雜交組織(或細胞)化學 (In situ Hybridization Histochemistry, ISHH) 簡稱原位雜交(In Situ Hybridization)，屬于固相分子雜交的范疇，它是用標記的DNA或RNA為探針，在原位檢測組織細胞內特定核酸序列的方法。根據所用探針和靶核酸的不同
，原位雜交可分為DNA-DNA雜交，DNA-RNA雜交和RNA-RNA雜交三類。根據探針的標記物是否直接被檢測，原位雜交又可分為直接法和間接法兩類。直接法主要用放射性同位素、熒光及某些酶標記的探針與靶核酸進行雜交，雜交后分別通過放射自顯影、熒光顯微鏡術或成色酶促反應直接顯示。間接法一般用半抗原標記探針，最后通過免疫組織化學法對半抗原定位，間接地顯示探針與靶核酸形成的雜交體。

??? 原位雜交能在成分復雜的組織中進行單一細胞的研究而不受同一組織中其他成分的影響，因此對于那些細胞數量少且散在于其他組織中的細胞內DNA或RNA研究更為方便；同時由于原位雜交不需要從組織中提取核酸，對于組織中含量極低的靶序列有極高的敏感性，并可完整地保持組織與細胞的形態，更能準確地反映出組織細胞的相互關系及功能狀態。

◆ 操作流程
??? 原位雜交反應（以DIG-cDNA探針為例）：
??? 取材
??? ●?0.1M PBS (pH 7.2) 浸 5-10min。
??? ●?0.1M甘氨酸/0.1M PBS 浸5min。
??? ●?0.3%TritonX-100/0.1M PBS 浸10-15min。
??? ●?0.1M PBS 洗 5min×3次，加蛋白酶K(1μg/ml)，37℃孵育30 min。
??? ●?4%多聚甲醛浸5min。
??? ●?0.1M PBS 洗 5min×2次，浸入新鮮配制的含0.25%乙酸酐/0.1M三乙醇胺中10min。
??? ●?預雜交：滴加適量預雜交液，42℃ 30 min。
??? ●?雜交：傾去預雜交液，在每張切片上滴加10-20μl雜交液（將探針變性后稀釋在預雜交液中，0.5 ng/μl ），覆以蓋玻片或蠟膜，42℃ 過夜。（陰性對照）
??? ●?洗片：(1) 4×SSC、2×SSC、1×SSC、0.5×SSC 37℃各洗20min；0.2×SSC 37℃洗10min；0.2×SSC與0.1M PBS各半洗10min；0.05M PBS 洗 5min×2次。
??? ●?3% BSA/0.05M PBS 包被，37℃ 30min.
??? ●?滴加抗地高辛-抗血清堿性磷酸酶復合物（以抗體稀釋液1:5000稀釋）4℃孵育過夜。
??? ●?0.05M PBS洗15min×4次; TSM1 10min×2次; 新鮮配制TSM2 10min×2次。
??? ●?顯色：在玻片上滴加適量顯色液，4℃避光過夜。
??? ●?將玻片置于TE中10-30min以終止反應。
??? ●?酒精梯度脫水、二甲苯脫脂。
??? ●?中性樹膠封片，顯微鏡下觀察結果。