代謝流組學（Metabolic Flux Analysis）檢測分析方案
項目簡介
1.1代謝流分析概述
為了深入了解細胞代謝過程，我們采用各種組學工具包括基因組學、宏基因組學、轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學進行分析。但由于這些組學技術目前無法充分反映轉錄后調控、酶活性及細胞過程。于是提出了代謝流組學（Fluxomics）來全面研究所有代謝物的流率（flux rates），這樣就可以很好的在生理上描述細胞的代謝活性。
基于13C或者15N標記的代謝流量分析方法能夠系統地定量細胞或者組織內代謝網絡的流量分布及各代謝途徑的相對貢獻，即通過13C標記實驗并結合2D-NMR波譜或GC-MS色譜信息來分析細胞內中間代謝物的13C標識狀態，從而系統地定量細胞內的各個代謝流量的相對大小及其分布變化，其優點是可以利用細胞內代謝物的質量同位體信息的分析方法，不但在很多情況下能夠直觀地表明代謝流量的整體走向，而且通過計算能夠準確定量地揭示細胞內各個代謝反應的活性，以及深入理解平行反應、可逆反應等多種復雜的細胞內代謝過程，直觀揭示細胞胞內的主要活性途徑及各個途徑的相對貢獻及其分布變化特點，從而鑒定出相關疾病發生發展過程的早期診斷的標志物及其關鍵的主要代謝通路，并揭示其相互調控規律，為疾病發生的臨床早期診斷、藥物靶點治療和預后判斷提供強有力的科學依據。
代謝流分析可以解決如下幾個問題：
通過比較不同環境條件及各種代謝性疾病的不同代謝途徑的代謝流量的分布變化，揭示出相關疾病發生發展過程中的主要代謝通路及其早期診斷的標志物。
通過13C代謝流量技術對胞內外的中間代謝物的變化示蹤，可以鑒定出基因工程菌的關鍵的代謝通路和活性，為最大程度提高目標代謝產物的合成提供直接的依據。

可以比較分析細胞，組織及其血樣和尿液在基因改造的前后的代謝功能變化。

圖1. 賴氨酸合成途徑與野生型途徑的代謝流差異

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圖2. 13C標記的谷氨酰胺碳代謝流網絡示意圖

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圖3.?葡萄糖及谷氨酰胺代謝網絡圖

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目前我公司代謝流分析技術路線圖如下：

圖4. 13C代謝流分析技術路線

1.2實驗設計
本課題擬采用小鼠心肌細胞作為研究對象，分有氧培養和無氧培養兩組，每組6個平行樣品，利用13C全標記的葡萄糖代謝流分析的方法研究其TCA，糖酵解途徑的代謝功能變化。
樣品詳情：共計12例樣品。

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1.3分析內容
基礎數據分析包括：數據預處理，代謝流通量分析，代謝流差異分析，層次聚類分析， Bi-plot分析。
1.4檢測平臺
代謝流分析檢測平臺：Orbitrap LC-MS，UHPLC-QQQ-MS，GC-Q-MS（根據項目需求選擇合適的平臺）

二、數據分析方案
基礎數據分析
2.1數據預處理
首先收集GC-MS(a-d圖)的代謝物的峰圖和同位體的信息，獲得代謝物的同位體信息。

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圖5. 總離子流（TIC）色譜圖及質譜信息

2.2 代謝流通量分析
我們運用是基于Matlab基礎的專業代謝流分析軟件Matlab flux-8 ，我們采用此分析軟件進行代謝流分析，此分析軟件將原先復雜繁瑣的矩陣計算過程模塊化，界面化，使用戶能夠直觀地構建代謝網絡，并能快速的進行代謝流分析。由于各元素的穩定同位素在自然界都穩定存在并占一定的比值，因此對各片段進行自然豐度校正，并計算各片段的質量同位體分布矩陣（MDV）。
首先，直接鑒定出每個化合物的同位體的分布信息如下部分數據：

表1. 化合物同位體分布及標記度分析

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表2. 不同樣品13C flux?ratio

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2.3代謝流差異分析

首先，根據13C Flux?ratio的數據，經過Normalization (Log Transformation)處理后，做Fold Change Analysis，或者T-test檢驗分析，鑒定出代謝網絡中發生代謝變化pathways的關鍵代謝物的13C Flux?ratio的變化，揭示其相應途徑的酶活性發生顯著性變化。例圖如下圖所示（大腸癌中關鍵serine 合成途徑發生了明顯變化，針對該途徑基因改造前后，比較分析其途徑中其13C Flux?ratio的變化）：

圖6. 不同樣品間各化合物13C Flux?ratio

Cell, 152, 599–611, January 31, 2013

2.4 差異化合物層次聚類分析

對Flux?ratio有差異的化合物進行層次聚類熱圖分析，如下圖通過分析其實驗組和對照組的代謝途徑的關鍵代謝物的變化，揭示其代謝通路及其酶活變化。

圖7. 差異化合物層次聚類圖

Cell,166, 1324–1337 August 31, 2016

2.5 Bi-plot分析

對所有數據進行Bi-plot分析能從總體上反應各組樣本之間的總體代謝差異和組內樣本之間的變異度大小，同時可以直觀地觀察樣品和代謝物之間的關系。使用SIMCA軟件(V14.1, Umetrics, Umea, Sweden)對數據進行UV格式化（Unit Variance Scaling）和平均中心化（Mean-Centered）處理，以獲得更加可靠且更加直觀的結果。軟件進行自動化模型擬合分析，獲得最可靠數學模型的主成分數目。例圖如下所示：

圖8. Bi-plot分析

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三：時間概算：
代謝流分析實驗檢測：45個工作日
代謝流分析數據分析：22個工作日

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