游離膽固醇(FC)是構成細胞膜的主要成分，也是合成性激素、膽汁酸、維生素D和腎上腺皮質激素等物質的重要原料，FC濃度可作為脂代謝的指標。本試劑盒的檢測方法是微量法，既可以用可見分光光度計檢測，也可以用酶標儀檢測。

作用原理是FC氧化酶可催化FC生成4-膽甾烯酮和H₂O₂，過氧化物酶催化H₂O₂、4-氨基安替比林和酚生成紅色醌類化合物，其在500 nm有吸收峰，顏色深淺與FC含量成正比。作用方式如下：

測定游離膽固醇(FC)請選擇60724ES 游離膽固醇(FC)含量檢測試劑盒;

測定總膽固醇(TC)請選擇60723ES 總膽固醇(TC)含量檢測試劑盒；

測定低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)請選擇60736ES 低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量檢測試劑盒；

測定高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)請選擇60737ES 高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量檢測試劑盒;

膽固醇檢測4款相關產品如下：

組分信息

使用說明

【注意事項】實驗之前建議選擇3個預期差異大的樣本做預實驗，如果樣本吸光值不在測量范圍內，建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

1.需自備的儀器和溶劑：

可見分光光度計/酶標儀、天平、低溫臺式離心機、水浴鍋/恒溫培養箱、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、可調式移液槍、EP管、蒸餾水和異丙醇。

2.溶液的配制：

1）自備提取液異丙醇：大約需要110 mL，常溫保存；試劑盒內提供一個30 mL棕色空瓶，僅做分裝使用。

2）標準品溶液的配置：10 mg膽固醇使用前加入517 μL提取液，振蕩溶解后即為50 μmol/mL的膽固醇標準溶液，2～8℃可保存4周。

3）工作液的配制：根據樣本量將試劑一：試劑二按 3 mL：20 μL（約16T）的比例配制工作液，現用現配。

3.操作步驟：

1）樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

a.組織：按照組織質量（g）：提取液體積（mL）為 1：5～10 的比例（建議稱取約0.1 g組織，加入1 mL提取液）進行冰浴勻漿。10000 g，4℃離心10 min，取上清置冰上待測。

^{b.細菌/細胞：按照細胞數量（104個）：提取液體積（mL）為 500～1000：1的比例（建議500萬細胞加入1 mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300 w，超聲2秒，間隔3秒，總時間3 min）；然后 10000 g，4℃離心10 min， 取上清置于冰上待測。}

c.血清（漿）等液體樣本：直接測定，若有沉淀請離心后取上清待測。

2）測定步驟

a.可見分光光度計/酶標儀預熱30 min以上，調節波長至500 nm，分光光度計蒸餾水調零。

b.按需取出一定量的工作液，臨用前37℃預熱10 min以上。

c.將50 μmol/mL膽固醇標準品用提取液進行稀釋得到2.5、2、1.25、0.625、0.3125、0.15625 μmol/mL的標準品備用。

備注：下述實驗中每個標準管需20 µL標準品（注意不要在此步驟直接檢測吸光度）。

d.在1.5 mL EP管/96孔板按下表步驟加樣

4.總膽固醇含量計算：

a.根據標準管的濃度（x，μmol/mL）和吸光度ΔA標準（y，ΔA標準），建立標準曲線。根據標準曲線，將ΔA測定（y，ΔA測定）帶入公式計算樣本濃度（x，μmol/mL）。

b.游離膽固醇的計算

（1）按血清（漿）等液體體積計算：FC含量（μmol/dL）=x×100×F

（2）按樣本蛋白濃度計算：FC含量（μmol/mg prot）=x×V提取÷（Cpr×V提取）×F =x÷Cpr×F

（3）按樣本質量計算：FC含量（μmol/g 質量）=x×V提取÷W×F =x÷W×F

（4）按細胞/細菌數量計算：FC含量（μmol/10⁶ cell）=x×V提取÷N×F =x÷N×F

100：單位換算系數，1 dL=100 mL；V提?。杭尤霕颖镜奶崛∫后w積，1 mL；W：樣本質量，g；N：細胞/細菌總數，以10⁶計；Cpr：蛋白濃度，mg/mL；F：樣本稀釋倍數。

5.實驗實例：

1）0.100g 小鼠腎臟加入1mL提取液進行冰浴勻漿，按照測定步驟操作，使用 96 孔板測得ΔA測定=A測定-A空白=0.278-0.046=0.232，根據標準曲線 y = 0.3016x + 0.0028，R²= 0.9996，計 算 x=0.760，按樣本質量計算含量得：

 FC含量（μmol/g質量）=x÷W×F =7.6 μmol/g質量。

2）取 10×10⁶個 Hela細胞加入0.5 mL提取液進行超聲破碎，按照測定步驟操作，使用96孔板測得 ΔA測定=A 測定-A 空白=0.110-0.046=0.064，根據標準曲線 y = 0.3016x + 0.0028，R² = 0.9996，計算 x=0.203，按細胞數量計算含量得：

 FC含量（μmol/10⁶ cell）= x×V 提取÷N×F =0.0102 μmol/10⁶ cell。

3）取大鼠血清樣本，直接按照測定步驟操作，使用96孔板測得ΔA測定=A測定-A空白=0.155- 0.046=0.109，根據標準曲線 y = 0.3016x + 0.0028，R²= 0.9996，計算 x=0.352，按血清（漿）等液體體積計算含量得：

FC 含量（μmol/dL）=x×100×F=35.2 μmol/dL。

2～8℃保存，有效期6個月。