質粒大提試劑盒說明書

貨號：D1110

規格：10次

保存：常溫保存，復檢期一年。

試劑盒內容：

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產品說明：

本試劑盒采用堿裂解法裂解細胞，根據離心吸附柱在高鹽狀態下特異性地結合溶液中的DNA的原理特異性提取質粒DNA。?離心吸附柱中采用的硅基質材料能高效、專一地吸附DNA，可最大限度去除雜質蛋白及細胞中其他有機化合物，一般從50-100ml大腸桿菌LB培養液中，可快速提取200-300μg高純度高拷貝的質粒DNA，提取率達85-90%。?使用本試劑盒提取的質粒DNA可適用于各種常規操作，包括酶切、PCR、測序、連接和轉化等試驗。

使用前請先在漂洗液中加入無水乙醇，加入體積請參照瓶體上的標簽。溶液Ⅰ在使用

前先加入RNaseA（將試劑盒中提供的?RNaseA?全部加入），混勻，置于?2-8℃保存。如非指明，所有離心步驟均為使用臺式離心機在室溫下離心。?

操作步驟:

1.?收集50-100ml過夜培養的菌液11000rpm離心10分鐘，盡量吸除上清(菌液較多時可以通過多次離心將菌體沉淀收集到一個離心管中)。

2.?向留有菌體沉淀的離心管中加入5ml溶液Ⅰ?(請先檢查是否已加入RNaseA)?，使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細菌細胞沉淀。注意：如果菌塊未徹底混勻，會影響裂解導致質粒提取量和純度偏低。

3.?向離心管中加入5ml溶液Ⅱ?，溫和地上下翻轉6-8次使菌體充分裂解。?注意：①翻轉一定要溫和，以免污染細菌基因組DNA。②作用時間不要超過5分鐘，以免質粒受到破壞。

4.?向離心管中加入7ml溶液Ⅲ?，立即溫和地上下翻轉6-8次，充分混勻，此時會出現白色絮狀沉淀(如菌液過多，可在此步放置5分鐘，以盡可能的降解RNA)。11000rpm離心10分鐘，用移液器小心地將上清轉移到另一個干凈的離心管中，注意盡量不要吸出沉淀。

注意：溶液Ⅲ加入后應立即混勻，避免產生局部沉淀。?如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。

5.?將上一步所得上清液加入吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，室溫放置2-3分鐘，11000rpm離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中(如為提高得率，可將收集管中的液體加入吸附柱再次吸附一次)。

6.?向吸附柱中加入8ml漂洗液(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，11000rpm離心2min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。

7.?向吸附柱中加入6ml漂洗液，11000rpm離心2min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。

8.?11000rpm離心5min，將吸附柱敞口置于室溫或50℃溫箱放置數分鐘，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，否則漂洗液中的乙醇會影晌后續的實驗如酶切、PCR等。

9.?將吸附柱放入一個干凈的離心管中，向吸附膜中央懸空滴加1-2ml經65℃水浴預熱的洗脫液，室溫放置5min，11000rpm離心2min，收集質粒溶液用于后續實驗。

10.?為了增加質粒的回收效率，可將得到的洗脫液重新加入吸附柱中，室溫放置5min，?11000rpm離心2min。

注意事項:

1.?使用前請先檢查溶液Ⅱ和溶液Ⅲ是否出現混濁，如有混濁現象，可在37℃水浴中加熱幾分鐘，待溶液恢復澄清后再使用。溶液Ⅱ?、溶液Ⅲ和漂洗液使用后應立即擰緊蓋子。

2.?洗脫緩沖液體積不應少于500ul，體積過小影響回收效率；洗脫液的pH值對洗脫效率也有影晌，若需要用水做洗脫液應保證其pH值在8.0左右(可用NaOH將水的pH值調至此范圍)，?pH值低于7.?0會降低洗脫效率。?DNA產物應保存在-20℃，以防DNA降解。

3.?如果所提質粒為低拷貝質粒或大于10kb的大質粒，應加大菌體使用量，使用400-800ml過夜培養物，同時按照比例增加溶液Ⅰ?、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的用量，吸附和洗脫時可以適當的延長時間，以增加提取效率。

4.?DNA濃度及純度檢測：得到的質粒DNA純度與樣品保存時間、操作過程中的剪切力等因素有關。?得到的TUNEology 波長可調檢測卡盒-->