?——即蛋白質藥物的圓二色譜分析技術服務

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目前研究蛋白質、多肽的二級及高級結構的方法有幾種，如X-ray晶體衍射技術、核磁共振技術和圓二色譜技術等。前兩種方法較復雜，并且受很多因素影響，分析起來比較困難。相對而言，圓二色譜是一種比較簡單且有效的技術，也是目前研究蛋白質二級結構的主要手段之一。

圓二色譜儀的工作原理是：利用蛋白質的圓二色性及不對稱分子對左右圓偏振光吸收的不同來進行結構分析。蛋白質或多肽中主要的光活性基團是肽鍵、芳香氨基酸殘基及二硫鍵等，當平面圓偏振光的吸收不相同時，會產生吸收差值。由于這種吸收差的存在，造成了偏振光矢量的振幅差，圓偏振光變成了橢圓偏振光，即蛋白質的圓二色性。通過圓二色譜掃描儀，可以在一定程度上分析蛋白質、多肽樣品的二級結構和高級結構。

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“蛋白質多肽的圓二色譜分析對于研究二級和高級結構非常有意義”

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技術指標

圓二色譜分析的供試品，大多數情況下的蛋白質和多肽。蛋白質的精確濃度是計算樣品二級結構的關鍵，一般要求樣品濃度為0.2μg/μl，濃度過高，測試時信號不好，需稀釋，樣品純度要在90%以上，不要添加任何保護劑或其它物質，樣品中應避免含有光吸收的雜質，緩沖劑和溶劑在配制溶液前最好做單獨的檢查，透明性極好的磷酸鹽可用作緩沖體系。

圓二色譜在遠紫外區的掃描圖譜，反映的是蛋白質肽鍵的排布信息，計算所得的是蛋白質二級結構比例，即α-螺旋、β-折疊、轉角和不規則卷曲的比例。

圓二色譜在近紫外區的掃描圖譜，反映的是蛋白質側鏈生色基團色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸等殘基的排布信息和二硫鍵微環境的變化。

案例分析

下圖分別為蛋白質樣品和其對照品在遠紫外區和近紫外區的Overlay圖。

圖為蛋白類供試品的遠紫外Overlay圖譜（藍色代表樣品，綠色代表對照品）

圖為蛋白類供試品的近紫外Overlay圖譜（藍色代表樣品，綠色代表對照品）

樣品及其對照品的二級結構含量分析結果如下圖，兩者的二級結構含量相似。

結果：樣品和對照品的遠、近紫外區的圓二色譜圖，經Overlay處理后圖譜基本重疊；遠紫外區的圓二色譜圖經過分析二級結構后，各種二級結構含量也基本一致，說明樣品和對照品具有一致的二級結構和空間結構。

Q&A

1)?????圓二色譜的解讀。

圓二色譜技術能快速、簡單、較準確地研究溶液中蛋白質和多肽的構象，并且運用斷流、電化學等附加裝置，結合溫度、時間等變化參數，已經廣泛用于了解蛋白質-配體的相互作用，監測蛋白質分子在外界條件誘導下發生的構象變化，探討蛋白質折疊、失活過程中的熱力學與動力學等多方面的研究。

2)?????圓二色譜分析的軟件介紹。

圓二色譜在遠紫外區的掃描圖譜，反映的是蛋白質肽鍵的排布信息，計算所得的是蛋白質二級結構比例；圓二色譜在近紫外區的掃描圖譜，反映的是蛋白質側鏈生色基團色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸等殘基的排布信息和二硫鍵微環境的變化。

目前用于拆分和估算的軟件不下十幾種，得到研究者廣泛認同的計算模式有幾種，但由于不同計算模式的理論基礎不同，所計算得到的蛋白質二級結構比例并不完全相同，但多數軟件對α-螺旋的估計還是比較準確的。APT采用JWSSE32軟件對樣品和對照品的二級結構進行擬合計算，參考標準曲線采用軟件自帶的標準α-螺旋（α-helix）、β-折疊（beta-pleated sheet）、轉角（turn）和不規則卷曲（random coil）曲線。由于本預測結構可能存在誤差，僅供參考之用。