Cal-770™作為新一代近紅外(NIR)鈣離子指示劑，具有約775nm的最大發射波長，是目前僅有激發和發射波長均超過700nm且具有適中鈣親和力(Kd≈850nM)的熒光鈣指示劑。憑借其獨特的近紅外熒光特性，Cal-770™成為極少數適用于活體成像研究的鈣離子探針，為深層組織成像提供了重要技術手段

實驗方案示例

鈣離子標準曲線建立實驗方案

鈣離子標準曲線可通過測量指示劑鹽形式（熒光酶標儀中使用25-50 µM濃度）在已知游離鈣離子濃度溶液中的熒光強度來建立。建議采用基于30 mM MOPS EGTA鈣離子緩沖體系的校準溶液。由于水中通常含有痕量鈣離子，強烈推薦使用30 mM MOPS + 100 mM KCl (pH 7.2)作為緩沖體系。可按以下方法配制0 µM和39 µM鈣離子儲備液，用于制備不同鈣離子濃度的梯度溶液：

A液（0 µM鈣離子）：

30 mM MOPS + 100 mM KCl (pH 7.2)緩沖液 + 10 mM EGTA

B液（39 µM鈣離子）：

30 mM MOPS + 100 mM KCl (pH 7.2)緩沖液 + 10 mM EGTA + 10 mM CaCl2

測定溶液游離鈣離子濃度或單波長鈣離子指示劑的Kd值時，需使用以下方程：

[Ca]_Free = K_d [F - F_min] / [F_max - F]

其中：

F - 特定鈣離子濃度下的熒光強度

Fmin - 無鈣條件下的熒光強度

Fmax - 鈣飽和狀態下的熒光強度

解離常數(Kd)反映探針對鈣離子的親和力。

注意：熒光指示劑的鈣結合特性和光譜特性在細胞環境與校準溶液中存在顯著差異。細胞內指示劑的原位校準通常獲得的Kd值明顯高于體外測定值。

原位校準方法：

離子載體法：將負載指示劑的細胞暴露于含有A-23187、4-溴代A-23187或離子霉素等鈣離子載體的可控鈣離子緩沖液中

細胞透化法：使用洋地黃皂苷或Triton® X-100等透化劑使指示劑接觸細胞外介質中的可控鈣離子水平

熒光檢測參數設置為：激發波長750nm/發射波長790 nm