女人与狗锁死了视频大全|霍金死亡过程恐怖视频|无节社团简谱季免费观看|六间房直播大厅|中文字幕欧美另类精品|久久人人玩人妻潮喷内射人人|亚洲国产一区二区三区在线观看

細(xì)胞描述

該細(xì)胞系被報(bào)道具有生殖能力，源自一個(gè)攜帶LacZ報(bào)告基因的C57BL/6轉(zhuǎn)基因小鼠。這段轉(zhuǎn)基因在pUC19中組裝，包含1.9 kb人54 HS-2片段（兩側(cè)KpnI/PvuII酶切位點(diǎn)），位于標(biāo)記的ß-珠蛋白轉(zhuǎn)基因上游。培養(yǎng)時(shí)需使用昆明白MEF（SCSP-101R）作為飼養(yǎng)層細(xì)胞。

細(xì)胞特性

1） 來(lái)源：小鼠，57BL/6Tac品系 內(nèi)細(xì)胞團(tuán)

2） 形態(tài)：球形克隆 貼壁生長(zhǎng)

3） 含量：>1x10^6  細(xì)胞數(shù)

4） 規(guī)格：1mL凍存管包裝

5） 用途：僅供科研使用

運(yùn)輸和保存

干冰運(yùn)輸：1mL凍存管包裝干冰運(yùn)輸，收到后-80度冰箱保存過(guò)夜后轉(zhuǎn)入液氮或直接復(fù)蘇，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染，請(qǐng)立即與我們聯(lián)系。

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備

1）準(zhǔn)備DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基                    (iCell-0001)                 81.5%      

      優(yōu)質(zhì)胎牛血清                                   （iCell-0500）              15 %

      GlutaMAX-1谷氨酰胺                        (iCell-0900)                 1 %

      MEM NEAA非必需氨基酸               (iCell-01000)                1%

      P/S青霉素-鏈霉素                       （iCell-15140-122）          1%

      β-巰基乙醇                                            (iCell-8211)               1.25 mL

      LIF  (iCell-50756)                                                                    10ng/mL

注意：

1、建議使用KM- MEF作為飼養(yǎng)層細(xì)胞。

2、在鋪胚胎干細(xì)胞前，需對(duì)MEF進(jìn)行處理，具體處理步驟見(jiàn)下文絲裂霉素滅活MEF。

3、該細(xì)胞建議凍存干冰發(fā)貨，不適合長(zhǎng)時(shí)間活細(xì)胞運(yùn)輸，會(huì)影響細(xì)胞活力。

2）培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3）凍存液：完全培養(yǎng)液 60%%，F(xiàn)BS 30%%，DMSO 10%%現(xiàn)用現(xiàn)配。

我?guī)靸龃鏁r(shí)，體積為 500 μl，預(yù)期存活率 70%，每支凍存管的細(xì)胞復(fù)蘇，3 至4 天后，會(huì)形成 30 至 40 個(gè)克隆，建議復(fù)蘇至 1 個(gè) T25 培養(yǎng)瓶中。

二：細(xì)胞處理

絲裂霉素滅活MEF

待MEF細(xì)胞密度達(dá)到80%以上，加入含絲裂霉素（15μg/mL）的MEF完全培養(yǎng)液，置于37培養(yǎng)箱中孵育2.5h，2.5h后，棄掉培養(yǎng)液，PBS清洗1-2遍，加入MEF培養(yǎng)基，備用，當(dāng)天2h后或者第二天可以傳入小鼠胚胎干細(xì)胞。

復(fù)蘇：

1.將小鼠胚胎干細(xì)胞凍存管從液氮中取出，置于 37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超凈臺(tái)內(nèi)用 75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁，防止污染。

2. 將凍存管內(nèi)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含 3-4 ml 小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液的 15ml 離心管內(nèi)，以 1000 rpm，離心 5 min。

3. 離心后將上清液吸除，另加入新鮮的小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液 2 ml，吹打懸浮。

4. 重復(fù)吹打，制成單細(xì)胞懸液，盡量避免氣泡。

5.  轉(zhuǎn)移至 1 個(gè)已經(jīng)鋪好 MEF 細(xì)胞的 T25 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

6. 每天更換小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液。

傳代：

1. 一般在復(fù)蘇后第 2-3 天傳代，視克隆大小和密度而定

2. 吸除廢液。

3. 用 PBS（不含鈣鎂離子）輕輕沖洗一遍。

4. 加入 1.0 ml 的 0.25%胰酶（含 EDTA）至培養(yǎng)瓶，輕輕晃動(dòng)，使胰酶覆蓋底面，置于 37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化細(xì)胞。

5. 在顯微鏡下觀察，直至細(xì)胞層全部脫落（一般需要 1-2 min）。

6.  加 2 ml 小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液終止消化。

7.  以 1000 rpm，離心 5 min，棄上清。

8. 加入約 1 ml 小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液，多次輕輕吹打細(xì)胞， 制成單細(xì)胞懸液。

9. 加入足量的小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液，吹打混勻，細(xì)胞懸液分裝到鋪好 MEF 細(xì)胞的 T25 培養(yǎng)瓶中。一般地，一個(gè) T25 培養(yǎng)瓶加入 5-6 ml 培養(yǎng)液。放入 37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每天換液。

傳代比例：1:4-1:7

凍存：

1.按傳代的方法將細(xì)胞消化下來(lái)，制成細(xì)胞懸液。

2.  以 1000 rpm，離心 5 min，棄上清，逐滴加入已經(jīng)預(yù)冷的凍存液，懸浮細(xì)胞。

3. 按每支存管內(nèi)加入 500 ml 細(xì)胞懸液分裝到凍存管內(nèi)，標(biāo)記細(xì)胞名稱、代數(shù)、凍存日期等基本信息。

4．將凍存管置于程序降溫盒內(nèi)，-80℃過(guò)夜，轉(zhuǎn)入液氮。

凍存液配方：

小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液 60%，ES 級(jí) FBS 30%，DMSO 10%

附：小鼠胚胎干細(xì)胞與 MEF 細(xì)胞分離的簡(jiǎn)易方法（差速貼壁法）：

1.培養(yǎng)中的小鼠胚胎干細(xì)胞，按傳代的操作方法將細(xì)胞用胰酶消化并吹打成單細(xì)胞懸液后，加入適量的提前溫育好的小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞， 吹打混勻，細(xì)胞懸液分裝到無(wú) MEF 細(xì)胞的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶（一般地，一個(gè)T25 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的小鼠胚胎干細(xì)胞，在一個(gè) 10 cm 培養(yǎng)皿中進(jìn)行差速貼壁。不要事先鋪明膠，如鋪明膠則細(xì)胞貼壁速度過(guò)快無(wú)法有效分離小鼠胚胎干細(xì)胞與 MEF 細(xì)胞）中。

2. 培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶置于 37°C 培養(yǎng)箱內(nèi)靜置 1 小時(shí)。

3.  1 小時(shí)后，絕大部分 MEF 細(xì)胞已貼在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶底面，而大部分小鼠胚胎干細(xì)胞仍然懸浮在培養(yǎng)液中。收取培養(yǎng)液，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。