生物素標記及效率檢測試劑盒

Biotin Labeling and Efficiency Detection Kit

 選購之前客戶需要根據待標記物的分子量大小和標記量選擇最適宜的型號

產品介紹：

本生物素快速標記試劑盒提供了生物素快速標記所需全部試劑，用于含有伯氨基（NH2-）的蛋白/抗體/多肽或者其他大分子的標記。其反應原理如下:

產品特點：

l   使用方法簡單，無需額外準備試劑；

l   節約時間，整個過程僅需 90min；

l   通過離心脫鹽和去除游離的生物素，無需透析或者凝膠過濾；

l   既可用于微量標記又可大量標記，每次可標記 0.2-2mg；

l   本試劑盒對于標記好的分子可以測試生物素標記效率，避免額外購買標記效率檢測試劑盒

生物素標記使用量的計算：

每個反應中生物素試劑的使用量取決于待標記蛋白質的量和濃度。例如，通過我們實驗數據分析表明，標記2mg/ml 的抗體（IgG ，150KD），使用生物素和抗體的分子比為 20:1 能達到最佳效果；其他蛋白的標記可以根據實際情況，參照此比例類推。

計算公式如下：

其中：

V(µL)為生物素的體積；                           V1(mL)為待標記物（蛋白/抗體/其他含有伯胺-NH2的大分子）；

   C1(mg/mL)為待標記物的濃度；                    R 為生物素與待標記物的分子比例；

   M為待標記物的分子量（道爾頓，Dalton，Da）      C(mM)為生物素的濃度

計算示例：我們將生物素配置成10mM的濃度，用來標記1mL的2mg/mL 的抗體（IgG ，150KD），準備加入的生物素與抗體的比例為20:1，那么帶入公式計算

⁶=26.66uL

實驗前準備：

1.按照生物素標記使用量的計算的公式計算所需要的生物素的量。

2.提前 20min 從冰箱中取出試劑盒，使試劑盒各組分平衡至室溫。

3.用助溶劑DMSO將活性生物素配制成10mM(2mg生物素加DMSO 440ul)。

 特別提示：

A.溶解的活性生物素建議一次性使用完，如使用不完可以密封放在-20℃的冰箱內，一月內可以使用，但是標記效率會降低；

B.生物素助溶劑使用完之后需要立即密封保存，防止吸潮。

操作步驟：（本操作步驟按照 1mg抗體的量進行標記）

1.   取1mg 待標記抗體于超濾管中，并加入相應體積的標記緩沖液，使抗體的終濃度為 2mg/mL，12,000 x g 離心 10min。

請注意：

A.超濾管的最大體積和最大截留分子量，本實例超濾管的最大體積為 0.5mL；

B.如果待標記抗體濃度低時，可先超濾離心濃縮；

C.如果待標記物含有游離的氨基（Tris,氨基酸或者其他干擾物，需要用標記緩沖液反復超濾確保其去除干凈）

2. 加入13.3µL生物素溶液和適量標記緩沖液至上述超濾管中，使終體積為 0.5ml，并輕輕吹打混勻。放入 37℃恒溫箱中避光溫育 30min。

3. 12,000 x g 離心 10min。

4. 加入適量標記緩沖液至上述超濾管中，并輕輕吹打混勻，12,000 x g 離心 10min， 重復此步驟多次。

5. 收集超濾管中的溶液（即生物素標記的抗體），加入等體積保存液，-20℃保存。

生物素標記的抗體測量標記效率（微孔酶標板法）：

A.      取180uL HABA- Avidin混合液放入微孔板中，在500nm波長測量吸光值，記錄為A_500(H-A);最好測量三次取平均值；

B.       在微孔板中加入20uL待測的生物素標記蛋白（Biotinylated Protein,簡稱BP），震蕩或移液器吹打充分混勻后，在500nm波長測量吸光值，吸光值穩定20秒以上，記錄為A_500(H-A-BP);最好測量三次取平均值；如果A_500(H-A-BP)< 0.3*A_500(H-A),請用PBS稀釋待測樣品，再次重復此步驟。

標記效率計算方法：

1）蛋白摩爾濃度計算：mM /mL

2）生物素摩爾濃度計算（微孔板法）：mM /mL

其中吸光值變化(微孔酶標板)：ΔA₅₀₀=A_500(H-A)- A_500(H-A-BP)

備注：使用標準96孔微孔板，200ul液體，其液面高度（光程）為0.58cm

4）標記摩爾比計算：

生物素：蛋白=[(生物素摩爾濃度*10)/蛋白原始摩爾濃度]*稀釋倍數

注意事項：

1. 本試劑盒也可標記其它含有氨基（NH2-）的抗原、HRP、多肽，具體標記比例根據待標記物中氨基的數量確定。

2. 本試劑盒中的生物素助溶劑為DMSO ，使用完畢后要密封干燥保存。

3. 本試劑盒未開封前的有效期為18個月，請在有效期內使用;本試劑盒中的生物素加入助溶劑之后，如果使用不完，請密封放在-20℃保存，一周內可以正常使用，如果超過一周，一個月之內使用，使用里量請酌情加大；超過一個月請不要再使用。

4. 請注意試劑盒中提供的超濾管的規格和分子截流大小來確定是否適合您的最佳標記條件；

5. 在步驟 2 中，標記其它抗體時，我們最好控制抗體的終濃度為 2mg/mL，然后再根據抗體的量計算應加入活性生物素的體積。

*本試劑僅供實驗室研究使用