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mRNA/miRNA/LncRNA 定量PCR

熒光定量PCR起源：

熒光定量PCR（也稱TaqMan PCR,以下簡(jiǎn)稱FQ-PCR）是美國(guó)PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來(lái)的一種新的核酸定量技術(shù)，該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針來(lái)實(shí)現(xiàn)其定量功能的，與變通PCR相比，F(xiàn)Q-PCR具有許多優(yōu)點(diǎn)，可以檢測(cè)mRNA、miRNA、LncRNA的表達(dá)情況。

與普通PCR相比，F(xiàn)Q-PCR具有許多優(yōu)點(diǎn)：

1、封閉反應(yīng)，無(wú)需PCR后處理。

2、特異性強(qiáng)，靈敏度高。

3、采用對(duì)數(shù)期分析，摒棄終點(diǎn)數(shù)據(jù)，定量準(zhǔn)確。

4、定量范圍寬，可達(dá)到10個(gè)數(shù)量級(jí)。

5、儀器在線式實(shí)時(shí)檢測(cè)，結(jié)果直觀，避免人為判斷。

6、可實(shí)現(xiàn)一管雙檢或多檢。

7、操作安全，縮短時(shí)間，提高效率。熒光定量PCR是通過(guò)對(duì)PCR 擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)檢測(cè)從而實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板定量及定性的分析。

熒光定量PCR分類：?
☆TaqMan熒光探針
????PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5‘-3‘外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。
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☆SYBR?Green熒光染料
????SYBR?Green是一種DNA結(jié)合染料，能非特異地?fù)饺氲诫p鏈DNA中去。在游離狀態(tài)下，它不發(fā)出熒光，但一旦結(jié)合到雙鏈DNA中以后，便可以發(fā)出熒光。它的最大優(yōu)點(diǎn)就是可以與任意引物、模板相配合，用于任意反應(yīng)體系中。從經(jīng)濟(jì)角度考慮，它也比其它的探針的價(jià)格要便宜得多。但由于它能與所有的雙鏈DNA結(jié)合，所以一旦反應(yīng)體系中出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，那它就會(huì)影響到定量結(jié)果的可靠性與重復(fù)性。要避免這種不利因素，可以通過(guò)選擇良好的引物并優(yōu)化反應(yīng)條件以消除非特異性影響。

●主要實(shí)驗(yàn)步驟如下：?

RT-qPCR是由三個(gè)步驟組成:
1.反轉(zhuǎn)錄:依賴反轉(zhuǎn)錄酶將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNDA;
2.擴(kuò)增:用PCR的方法擴(kuò)增cDNA;
3.檢測(cè):實(shí)時(shí)檢測(cè)和定量擴(kuò)增的產(chǎn)物.

具體實(shí)驗(yàn)操作步驟：

1. 設(shè)計(jì)并合成Realtime?PCR引物。?
   2.?引物溶解后使用Promega的TaqDNA聚合酶進(jìn)行含SG（SYBR?；?Green）的PCR反應(yīng)的優(yōu)化。?
   3.?客戶樣品RNA抽提?。
   實(shí)驗(yàn)對(duì)象為組織樣品，取適量（50-100mg）新鮮組織樣品或正確保存的組織樣品加1ml的RNA抽提試劑Trizol（Invitrogen），勻漿后抽提RNA。?
   實(shí)驗(yàn)對(duì)象為細(xì)胞樣品，每份樣品取1×106～1×107細(xì)胞，PBS清洗細(xì)胞，去PBS加1ml的RNA抽提試劑Trizol（Invitrogen），裂解后抽提RNA?。
   4.?RNA質(zhì)量檢測(cè)??
   a.?紫外吸收測(cè)定法測(cè)定RNA在分光光度計(jì)260nm和280nm處的吸收值，以計(jì)算其濃度并評(píng)估RNA純度?。
   b.?使用ambion公司的甲醛電泳試劑進(jìn)行變性瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)RNA純度及完整性。?
   5.?使用逆轉(zhuǎn)錄酶（Promega）進(jìn)行反應(yīng)，將樣品RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。?
   6.?制備標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品：?
   進(jìn)行相對(duì)定量，需要先將樣品的目的基因以及管家基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其產(chǎn)物進(jìn)行梯度稀釋用于做標(biāo)準(zhǔn)曲線。?
   7.?標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品和待測(cè)樣品分別加入到含SG的RealTime?PCR反應(yīng)液中，進(jìn)行RealTime?PCR擴(kuò)增和檢測(cè)。?
   8.?檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線分析：以對(duì)待測(cè)樣品的目的基因進(jìn)行定量。相對(duì)定量實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)一步用樣品的目的基因測(cè)得值除以管家基因測(cè)得值以校正誤差，所得結(jié)果代表某樣品的目的基因相對(duì)含量。?
   9.?提供實(shí)驗(yàn)報(bào)告：包括詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方法及實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果的相關(guān)圖表?。

熒光定量PCR中的一些術(shù)語(yǔ)

1. CT值：熒光信號(hào)有統(tǒng)計(jì)意義顯著增長(zhǎng)(即穿過(guò)閾值線)時(shí)的循環(huán)次數(shù)，或者說(shuō)是從基線到指數(shù)增長(zhǎng)的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。
2. 閾值：閾值的默認(rèn)設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。
3. CT值與起始模板的量成線性關(guān)系。

客戶需知：

• 請(qǐng)您提供新鮮的且盡量多的材料，或直接提供純化好的總RNA或DNA（大于5ug/樣本）。如是如織：100－200mg
• 請(qǐng)通過(guò)EMAIL提供已知的全長(zhǎng)基因序列。
• 請(qǐng)?zhí)峁┰敿?xì)背景資料：DNA/RNA來(lái)源，豐度。

結(jié)果提供：

• 實(shí)驗(yàn)詳細(xì)步驟，和相關(guān)數(shù)據(jù)。
• 標(biāo)準(zhǔn)曲線，擴(kuò)增曲線，溶解曲線。
• 完整的實(shí)驗(yàn)報(bào)告（含軟件分析結(jié)果）

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