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在蛋白質結構解析與生物制藥研發中，二硫鍵是維持蛋白高級結構穩定性的關鍵共價連接。尤其是在抗體藥物、重組蛋白及復雜生物制劑中，二硫鍵的正確配對直接決定了蛋白的折疊狀態、生物活性與安全性。因此，基于 LC-MS/MS的二硫鍵映射分析已成為蛋白質組學與結構生物學中的核心技術之一。

一、LC-MS/MS二硫鍵映射分析的基本原理

LC-MS/MS二硫鍵映射的核心目標，是在保持或選擇性破壞二硫鍵結構的前提下，通過質譜技術識別連接兩個半胱氨酸殘基的肽段組合關系。

其基本邏輯包括：

• 蛋白酶解后形成含二硫鍵的交聯肽段
• LC分離復雜肽混合物
• MS/MS碎裂獲得肽段序列信息
• 生物信息學分析重建Cys–Cys連接關系

二硫鍵映射強調的是結構完整性保留與交聯信息解析，因此對樣品處理與數據分析要求更高。

二、完整LC-MS/MS二硫鍵映射分析工作流程

1、樣品制備與二硫鍵保護

樣品制備是整個流程中最關鍵的起點，其核心目標是避免非特異性二硫鍵斷裂或重排。

常見策略包括：

• 使用溫和裂解條件（避免強酸、強堿、高溫）
• 避免使用DTT、TCEP等還原劑（非還原模式分析時）
• 添加尿素或鹽酸胍進行輕度變性，提高酶解效率
• 控制金屬離子污染，減少氧化/重排反應

在工業級蛋白或抗體樣品中，這一步往往決定后續數據質量的上限。

2、酶解策略優化（Trypsin / 多酶聯合）

蛋白質需被切割為適合質譜分析的肽段，但二硫鍵會限制酶切位點的可及性。

常見策略：

• 胰蛋白酶（Trypsin）單獨酶解：適用于結構較簡單蛋白
• 多酶組合（Trypsin + Glu-C / Lys-C）：提高覆蓋率
• 分級酶解策略：先部分解折疊區域，再進一步消化

關鍵目標是獲得合適長度肽段（6–25 aa）以及保留完整二硫鍵連接信息的交聯肽

液相色譜（LC）在二硫鍵映射中起到“分辨復雜信號”的作用。

常用策略：

• 反相高效液相色譜（RP-HPLC）
• 梯度優化（通常20–35% ACN區間增強分離）
• 延長梯度時間以提高低豐度交聯肽分辨率

對于抗體或復雜糖蛋白體系，多維LC（2D-LC）可顯著提升覆蓋深度。

4、MS/MS數據采集策略

LC-MS/MS分析中，碎裂模式選擇直接影響二硫鍵識別成功率。

常見策略包括：

（1）HCD（高能碰撞解離）

• 適合常規肽段分析
• 可產生豐富b/y離子
• 但對交聯肽解析有限

（2）ETD/EThcD（電子轉移解離）

• 更適合二硫鍵保持狀態分析
• 可保留修飾信息
• 是二硫鍵映射的關鍵技術之一

（3）數據采集模式

• DDA（數據依賴采集）：適合探索性分析
• DIA（數據非依賴采集）：適合高覆蓋定量分析

在高端蛋白結構分析中，常采用DDA + ETD組合策略以提高二硫鍵定位準確性。

5、二硫鍵肽段鑒定與數據庫分析

質譜數據生成后，需要通過專業軟件進行二硫鍵配對分析。

• 常用工具包括pLink / pLink2、Byonic、Protein Prospector、MassMatrix
• 分析核心包括：交聯肽段匹配、Cys-Cys配對組合推斷、MS/MS碎片離子驗證、假陽性過濾（FDR控制）

6、二硫鍵網絡重構與結構驗證

最終目標是構建完整的二硫鍵連接圖譜：

• 確定每個Cys的配對關系
• 驗證是否存在錯配或異構體
• 與理論結構（AlphaFold或晶體結構）比對
• 結合功能實驗進行驗證

對于抗體藥物，還需重點分析重鏈-輕鏈二硫鍵、鉸鏈區結構穩定性。

三、LC-MS/MS二硫鍵映射的關鍵技術挑戰

盡管技術已較成熟，但在實際應用中仍存在多重挑戰：

1、二硫鍵重排

樣品處理不當會導致非天然配對，影響結構判斷。

2、低豐度交聯肽難檢測

交聯肽離子化效率低，容易被普通肽段信號淹沒。

3、數據解析復雜

交聯組合指數級增長，計算負擔大。

4、大分子蛋白覆蓋不足

單抗、融合蛋白等體系難以實現100%覆蓋。

LC-MS/MS二硫鍵映射分析是一項融合樣品制備、色譜分離、質譜檢測與生物信息學分析的綜合性技術。隨著生物制藥與蛋白質工程的發展，對二硫鍵解析的精度與深度要求不斷提高。未來，該技術將進一步向高通量、高自動化與高結構解析度方向發展。在這一過程中，百泰派克生物科技通過整合先進質譜平臺與定制化分析流程，持續為科研機構與生物醫藥企業提供高質量的蛋白結構解析服務，助力從基礎研究到藥物開發的全鏈條創新。

百泰派克生物科技特色項目

一、蛋白測序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos質譜儀及島津公司埃德曼降解測序系統對蛋白質序列進行分析，提供基于質譜的蛋白測序分析服務，包括對蛋白質的氨基酸組成分析，N端測序，C端測序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白質N端序列分析服務。對于未知理論序列的蛋白質，提供基于從頭測序法的蛋白質從頭測序服務，對蛋白序列進行分析。

※服務優勢：

1.采用目前世界上先進的質譜儀器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可實現對所測定靶蛋白序列 100% 的覆蓋;

3.可測定蛋白N端多達 70個氨基酸序列;

4.可測定多種形式的樣品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白條帶;

5.樣品用量低: 蛋白樣品僅需 5-10ug，即可完成檢測;

6.測序不受N端封閉，PEC和和糖基化等N端修飾的影響。

二、蛋白質組學

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos質譜平臺結合Nano-LC，提供定量蛋白質組學、靶向蛋白質組學、多肽組學、翻譯后修飾蛋白組學等多種蛋白質組學分析服務。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白質組學服務，助力微量樣本蛋白組學、大樣本群醫學及高通量修飾組學等研究工作。

※服務優勢：

1 .高通量定量蛋白分析:多對照組大規模實驗分析，發現新的生物標記物;

2.體內體外多種蛋白質標記方法，適用于分析組織、細胞、血液等多種樣品;

3.質譜分析靈敏度高，實驗結果重復度高;

4.可檢測較低豐度蛋白，線性范圍廣;

5.專業生物信息學分析，分析更系統準確。

三、單細胞質譜流式技術分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm質譜流式系統進行單細胞質譜流式技術分析，采用金屬元素標記物（通常是金屬元素標記的特異抗體）標記細胞表面和內部的分子，然后用流式細胞原理分離單個細胞，再用電感耦合等離子體質譜（ICP-MS）分析單個細胞的原子質量譜，最后將原子質量譜數據轉換為細胞表面和內部的信號分子表達量。

※服務優勢：

1.技術先進，填補技術空白

采用金屬標記抗體技術，避免了傳統流式熒光通道少且易相互影響的問題。可在單細胞層面上對多種指標同時進行表征，百泰派克生物科技可做到同時檢測51個目標蛋白。

2.分析數量大，成本較低

單細胞RNAseq受成本等因素限制，所有樣本細胞匯總的分析數目一般在2x10^4個左右，而流式質譜技術一次（單樣本）就可分析至少10^5的細胞，實現了數量級的提高，且成本不高于單細胞RNAseq。

3.應用前景大

①流式質譜結果可以給出細胞亞群的變化，在臨床診斷、疾病機制研究等方面具有極大的研究前景；

②將金屬標簽技術與其他技術結合會有新應用方向。除常規蛋白外，質譜流式細胞技術還可用于蛋白翻譯后修飾；

③可檢測細胞存活率、細胞大小、mRNA轉錄子表達量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度質譜的免疫多肽組學分析及新抗原發現

百泰派克生物科技的基于高精度質譜的免疫多肽組學分析及新抗原發現一站式解決方案包括我們專有的、高度敏感的免疫肽富集和鑒定方案。我們能夠幫助您實現10,000個以上I型多肽和10,000個以上II型多肽的鑒定和識別。通過我們優化的高通量免疫多肽組學分析平臺進行免疫肽組學分析，可從最小的樣品材料中進行可重復的識別和定量。該服務可以應用于大規模的研究，旨在助力科研工作者尋找癌癥、免疫疾病及傳染病的解決方案，深入挖掘未知的靶標。

五、生物藥物表征

百泰派克基于高分辨率質譜技術，MALDI TOF，高效色譜分離技術，提供一系列完善的生物藥物分析方案，從蛋白質、多肽、抗體、疫苗等生物制品的氨基酸組成和一級結構分析，到產品變異性和純度分析。旨在提供優質生物藥物分析服務，幫助生物醫藥生產商提高生物藥物品質。

百泰派克生物科技七大檢測平臺

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物質譜多組學優質服務商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于為生物/制藥和醫療器械行業提供質量控制檢測和項目驗證等專業服務。公司實驗室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法規和指導原則，通過CNAS/ISO9001雙重質量體系認證，建立了完備的質量體系，數據冷熱/異地備份，設備定期計量/期間核查，軟件審計追蹤，為客戶提供一體化解決方案和技術服務，支持新藥研發、藥物申報注冊和生產放行。

1.公司采用ISO9001質量控制體系，專業提供以質譜為基礎的CRO檢測分析服務；

2.獲國家CNAS實驗室認可，為客戶提供符合全球藥政法規的藥物質量研究服務；

3.業務范圍覆蓋蛋白質組學、多肽組學、代謝組學、生物藥物表征、單細胞分析、單細胞質譜流式、生信云分析以及多組學生物質譜整合分析等；

4.七大質量控制檢測平臺，滿足您一站式服務需求；

5.服務3000+企業，10000+客戶的選擇；

6.致力于為您提供優質的生物質譜分析服務!

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