細胞基因敲除（敲入）全套服務
產品名稱： 細胞基因敲除（敲入）全套服務
英文名稱： Cas9
產品編號：
產品價格： 41800
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吉滿生物科技（上海）有限公司
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細胞基因敲除（敲入）全套服務
預實驗：
1.?????? Cas9導入細胞方法：嘗試各種方法，如脂質體類轉染、電轉、慢病毒感染、腺病毒感染等，確定高效導入Cas9方法。
2.?????? 藥物濃度預實驗：降低后續陽性克隆篩選和檢測工作難度。
3.?????? 單克隆培養情況：觀察細胞是否可以單克隆培養。
基因敲除（敲入）：
1.?????? 靶點設計
一般在不同轉錄產物的共同外顯子上設計3個靶點，靶點位置盡量在基因CDS的前1/3，ATG之后，最好能破壞重要的domain和所有的轉錄產物isoform。第一批合成構建3個，效果不佳或時間緊張的可一次構建6個。
2.?????? 載體構建和病毒包裝
根據預實驗結果，選擇合適的普通載體或病毒載體，吉滿生物現擁有3類載體：普通Cas9載體、慢病毒Cas9載體和腺病毒Cas9載體。
3.?????? 內源活性篩選
轉染細胞或感染細胞48H后，使用Puro或Blasticidin篩選48H,提取基因組DNA。使用T7E1酶驗證打靶載體的活性。將有效的突變型PCR產物測序驗證。
4.?????? Donor載體(基因敲入)
根據篩選的gRNA靶點位置，構建Donor普通載體或腺病毒載體。共轉染/感染 Cas9-gRNA和Donor.
5.?????? 單克隆篩選
無限稀釋到每孔1個細胞的數量，每株細胞鋪至少2個96孔板。細胞長好夠，驗證內源活性并送測。
6.?????? 獲得突變型
如需純合子，則可能需要重復步驟3-5。
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