免疫組織化學試劑盒組成及操作規程
一、實驗原理與意義 免疫組織化學是指帶顯色劑標記的特異性抗體在組織細胞原位通過抗原抗體反應和組織化學的呈色反應，對相應抗原進行定性、定位、定量測定。借助顯微鏡(包括熒光顯微鏡、電子顯微鏡)的顯像和放大作用，在細胞、亞細胞水平檢測各種抗原物質(如蛋白質、多肽、酶、激素、病原體以及受體等)。
二、實驗器材 微波爐、吹風機、組化筆、濕盒、烤箱、振蕩器、染缸、光學顯微鏡、純木漿衛生紙、計時器和通風櫥等。
三、試劑配制
1. PBS干粉( 2 袋)：每袋加1000ml蒸餾水溶解后為0.01 M PBS pH 7.2-7.4
2. 檸檬酸鹽干粉（ 1 袋）：每袋加1000ml蒸餾水溶解后0.01 M檸檬酸緩沖液 PH6.0
3. 30%H2O2： 70 ml
4. 封閉血清工作液： 11 ml 10%山羊血清
5. 抗體稀釋液: 30 ml
6. HRP-二抗： 0.5 ml
7. DAB（避光）：用20×DAB（1％，10 mg/ml）5 ul＋0.1 ul 30% H2O2＋95 ul PBS。
8. 蘇木精染液：①用蒸餾水50ml加熱溶解硫酸鋁鉀干粉3.75g；②用無水乙醇2.5ml溶解木精干粉后倒入溶液①中，煮沸1min后，稍冷卻，慢慢加入紅色氧化*干粉0.125g，繼續加熱至溶液變為紫紅色，用紗布蓋瓶口，用前濾紙過濾后每50ml加冰醋酸2.5ml。
9. Xylene、梯度Ethanol（100％×2、95％、70％、50％）、雙蒸水、中性樹膠（封裱劑）：為實驗室常用試劑，本試劑盒不提供。
四、操作步驟
1、脫蠟、水化
1) 60 ℃×60 min→Xylene（1） 10 minutes；
2) Xylene（2） 10 minutes；
3) 100% absolute ethanol（1）：5 minutes；
4) 100% absolute ethanol（2）：5 minutes；
5) 95% ethanol 2 minutes；
6) 70% ethanol 2 minutes；
7) distilled water:5 min；
8) PBS洗2次×3 min。
2、封閉內源性過氧化物酶
9) 用3％H2O2（用蒸餾水10倍稀釋即為3% H2O2）RT避光浸潤切片30 min。
10) PBS溶液洗3次×3 min。
3、抗原修復暴露抗原決定族
11) 切片放入0.01 M檸檬酸鈉緩沖溶液（pH6.0）后，在微波爐里高火4 min至沸騰后，再加熱約4 min×4次，每次間隔1min，補足液體，防止干片。
4、封閉非特異性蛋白
12) PBS溶液洗3次×3 min；
13) 將切片取出,周圍水分用濾紙吸干,用組化筆在組織周圍畫上圈,在圓圈內組織滴入10%羊血清（與二抗來源一致）后放入濕盒中,室溫30min；
5、一抗孵育
14) 甩去切片上的羊血清,用濾紙擦干組織周圍殘留血清，直接加入已稀釋的一抗100ul，放入濕盒中室溫1小時，然后4度過夜，從冰箱中取出需37 ℃復溫45 min。
6、二抗孵育
15) 將一抗倒掉并用PBS洗5 min×5次；
16) 用濾紙將圓圈周圍的水吸去，加入已稀釋的二抗100ul放入37 ℃恒溫烤箱中30 min。
17) 用PBS洗2次×10 min；
7、顯色
18) 加入DAB（快速滴入，觀察染**況，倒掉染液），顯色時間控制在約2 min，由鏡下觀察顏色控制時間。
8、復染、脫水、透明、封片
19) 用PBS 3次×3min后，用雙蒸水洗5 min；
20) 加一大滴蘇木素染液，染10min，用1%鹽酸酒精溶液分化20s后，用1%氫氧化氨溶液反藍2min，雙蒸水洗5 min。
21) 脫水： 50% ethanol 2 min，
70% ethanol 2 min
95% ethanol 2 min；
95% ethanol 2 min；
100% absolute ethanol（1）: 2min；
100% absolute ethanol（2）: 2min。
22) 透明：Xylene 1×2 min→Xylene 2×2 min
23) 封片：中性樹膠。
五、注意事項
1. 蘇木素復染時間需要摸索，尤其陽性染色也在細胞核上。
2. DAB顯色時間需要達到最優化，鏡下觀察達到陽性染色明顯但背景不太深。
3. 抗體濃度需要摸索。一抗孵育最好在4度過夜。
4. 切片脫蠟和水化要充分；加反應液時要覆蓋組織充分；每次加液前甩干洗滌液但要防止干片。