免疫組化

免疫組化染色實驗原理及步驟

實驗原理  抗體和抗原之間的結合具有高度的特異性，免疫組織化學正是利用了這一原理。先將組織或細胞中的某種化學物質提取出來，以此作為抗原或半抗原，通過免疫動物后獲得特異性的抗體，再以此抗體去探測組織或細胞中的同類的抗原物質。由于抗原與抗體的復合物是無色的，因此還必須借助于組織化學的方法將抗原抗體結合的部位顯示出來，以其達到對組織或細胞中的未知抗原進行定性，定位或定量的研究。

免疫組化染色實驗步驟

1. 石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-75%酒精5min，自來水洗；

2. 抗原修復：組織切片置于盛滿檸檬酸（PH6.0)抗原修復液的高壓鍋內進行抗原修復，噴氣計時2.5min， 自然冷卻后將玻片置于 PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次，每次 5min；

3. 阻斷內源性過氧化物酶：切片放入0.3%甲醇過氧化氫溶液，室溫避光孵育 20 min，將玻片置于 PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次，每次 5min；

4. BSA 或者血清封閉:切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈（防止抗體流走），在圈內滴加用 5%BSA，室溫封閉 1h；

5. 加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內 4°C 孵育過夜（濕盒內加少量水防止抗體蒸發）；

6.  加生物素二抗：玻片置于 PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次，每次 8min；切片稍甩干后在圈內滴加生物素偶聯的二抗，覆蓋組織，室溫孵育 50min；

7. 加鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化物酶：之后玻片置于 PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次，每次 8min；切片稍甩干后在圈內滴加鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化物酶，覆蓋組織，室溫孵育 50min；之后玻片置于 PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次，每次 8min；

8.  DAB 顯色：玻片置于 PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次，每次 5min；切片稍甩干后在圈內滴加新鮮配制的 DAB 顯色液，顯微鏡下控制顯色時間，陽性為棕黃色， 自來水沖洗切片終止顯色；

9.  復染細胞核：Harris 蘇木素復染 3min 左右，自來水洗，分化液分化數秒，自來水沖洗，流水返藍；

10.  脫水封片：將切片依次放入 75%酒精 6min-85%酒精 6min --無水乙醇Ⅰ6min -無水乙醇Ⅱ6min -二甲苯Ⅰ7min -二甲苯Ⅱ7min中脫水透明，將切片從二甲苯拿出來稍晾干，中性樹膠封片；

11.  顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

三、染色結果判讀：蘇木素染細胞核為藍色，DAB 顯出的陽性表達為棕黃色。

免疫熒光

免疫熒光染色實驗原理及步驟

實驗原理   免疫學的基本反應是抗原-抗體反應。由于抗原抗體反應具有高度的特異性，所以當抗原抗體發生反應時，只要知道其中的一個因素，就可以查出另一個因素。免疫熒光技術就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標記在抗體（或抗原）上，與其相應的抗原（或抗體）結合后，在熒光顯微鏡下呈現一種特異性熒光反應。

免疫熒光染色實驗步驟

1. 石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ8min-二甲苯Ⅱ8min-無水乙醇Ⅰ 6min-無水乙醇Ⅱ 6min-95%酒精  6min-85%酒精 6min-75%酒精  5min-流水沖洗；

2. 抗原修復：組織切片置于盛有檸檬酸（PH6.0)抗原修復液的高壓鍋內進行抗原修復，噴氣計時2.5min， 自然冷卻后將玻片置于 PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次，每次 5min；

3. 滅活：0.3%甲醇過氧化氫滅活15min，PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次，每次 6min；

4. BSA 或者血清封閉:切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈（防止抗體流走），在圈內滴加用 5%BSA，室溫封閉 1h；

5. 加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內 4°C 孵育過夜（濕盒內加少量水防止抗體蒸發）；

6. 加二抗：玻片置于 PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次，每次 8min。切片稍甩干后在圈內滴加與種屬對應的熒光二抗，覆蓋組織，室溫孵育120min。之后玻片置于 PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次，每次 8min；

7.  DAPI染核：滴加 DAPI，室溫孵育10min，之后玻片置于 PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次，每次 6min；

8. 封片：抗熒光淬滅劑封片；

9. 鏡檢拍照：切片于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。（DAPI紫外激發波長330-380nm，發射波長420nm，發藍光；FITC激發波長465-495nm，發射波長515-555 nm，發綠光；CY3激發波長510-560，發射波長590nm，發紅光）。

染色結果判讀：DAPI染出來的細胞核在紫外的激發下為藍色，陽性表達為相應熒光素標記的紅光或者綠光。

多重免疫熒光

多重熒光染色實驗原理及步驟

實驗原理   酪酰胺信號放大(TSA，Tyramide signal amplification)技術是一類利用辣根過氧化酶(HRP)對靶蛋白進行標記的酶學檢測方法，類似常規免疫組化的DAB顯色方法，TSA技術同樣采用HRP標記的二抗，同樣有對應的“顯色”步驟(HRP催化加入反應體系的酪胺熒光素底物，產生活化熒光底物，活化底物可與抗原上的酪氨酸等殘基共價結合，使樣品上穩定的共價結合酪胺熒光素。之后用熱修復法或者抗體洗脫液洗去非共價結合的一抗-二抗-HRP復合物，重復下一種一抗-hrp二抗來第二輪孵育，換另一種酪胺熒光素底物，如此往復就可實現多重標記。

免疫熒光染色實驗步驟：

1. 復溫，水洗：將切片從-20℃拿出來復溫30min，蒸餾水洗兩次，每次8min；

2. 固定：將切片至于4%的多聚甲醛中固定15min，用PBS洗3次，每次5min；

3. 通透：滴加0.3%Triton-X100破膜液通透20min，用PBS洗3次，每次5min；

4. 阻斷內源性過氧化氫酶：切片入3%過氧化氫溶液，室溫避光孵育15min，用PBS洗3次，每次5min；

5. 封閉：切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈（防止抗體流走）,在圈內滴加5%BSA，室溫封閉1h；

6. 加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內4℃孵育過夜（濕盒內加少量水防止抗體蒸發）；

7. 復溫：濕盒從4℃拿出來復溫1h，將玻片置于PBS（PH7.4）在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次8min；

8. 加HRP二抗：切片稍甩干后在圈內滴加與種屬對應的HRP二抗，覆蓋組織，室溫避光孵育50min，將玻片置于PBS（PH7.4）在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次8min；

9. TSA熒光染料反應液反應FITC（TYR-488）：切片滴加TSA熒光染料反應液均勻覆蓋組織反應10min，將玻片置于PBS（PH7.4）在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次8min；

10. 抗體洗脫：將切片置于抗體洗脫液中洗脫15min，將玻片置于PBS（PH7.4）在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次8min；

11. 加第二種一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內4℃孵育過夜（濕盒內加少量水防止抗體蒸發）；

12. 復溫：濕盒從4℃拿出來復溫1h，將玻片置于PBS（PH7.4）在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次8min；

13. 加HRP二抗：切片稍甩干后在圈內滴加與種屬對應的HRP二抗，覆蓋組織，室溫避光孵育50min，將玻片置于PBS（PH7.4）在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次8min；

14. TSA熒光染料反應液反應cy3（TYR-555）：切片滴加TSA熒光染料反應液均勻覆蓋組織反應10min，將玻片置于PBS（PH7.4）在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次8min；

15. 抗體洗脫：將切片置于抗體洗脫液中洗脫15min，將玻片置于PBS（PH7.4）在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次8min

16. 加第三種一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內4℃孵育過夜（濕盒內加少量水防止抗體蒸發）；

17. 復溫：濕盒從4℃拿出來復溫1h，將玻片置于PBS（PH7.4）在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次8min；

18. 加HRP二抗：切片稍甩干后在圈內滴加與種屬對應的HRP二抗，覆蓋組織，室溫避光孵育50min，將玻片置于PBS（PH7.4）在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次8min；

19. TSA熒光染料反應液反應594（TYR-594）：切片滴加TSA熒光染料反應液均勻覆蓋組織反應10min，將玻片置于PBS（PH7.4）在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次8min；

20. 抗體洗脫：將切片置于抗體洗脫液中洗脫15min，將玻片置于PBS（PH7.4）在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次8min

21. 加第四種一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內4℃孵育過夜（濕盒內加少量水防止抗體蒸發）；

22. 復溫：濕盒從4℃拿出來復溫1h，將玻片置于PBS（PH7.4）在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次8min；

23. 加HRP二抗：切片稍甩干后在圈內滴加與種屬對應的HRP二抗，覆蓋組織，室溫避光孵育50min，將玻片置于PBS（PH7.4）在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次8min；

24. TSA熒光染料反應液反應cy5（TYR-647）：切片滴加TSA熒光染料反應液均勻覆蓋組織反應10min，將玻片置于PBS（PH7.4）在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次8min；

25. DAPI染核：將玻片置于PBS（PH7.4）在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次8min；滴加DAPI,室溫避光孵育10min，之后將玻片置于PBS（PH7.4）在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次6min；

26. 封片：抗熒光淬滅劑封片；

27. 鏡檢拍照：切片于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，（DAPI紫外激發波長330-380nm，發射波長420nm，發藍光；FITC激發波長465-495nm，發射波長515-555 nm，發綠光；CY3激發波長510-560，發射波長590nm，發紅光. 647熒光激發波長 608-648nm, 發射波長672-712,，原本為正紅色，為了與CY3區分開，我們設定為粉色光。 594激發波長594nm，發射波長615nm. 我們設定為紫紅色。）。